DNA第2代測序技術(shù)

DNA第2代測序技術(shù)與遺傳學發(fā)展一.DNA第2代測序技術(shù)二.遺傳學的發(fā)展三.第2代測序技術(shù)對遺傳學發(fā)展的影響1.1什么是DNA第2代測序技術(shù)第2代測序技術(shù)（next-generationsequencing）是對傳統(tǒng)Sanger法測序的一次革命性的改變，是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的高通量的測序技術(shù)，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。

一.DNA第2代測序技術(shù)1.2為什么要發(fā)展第2代測序技術(shù)快速和準確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科學研究一直具有十分重要的意義。對于每個生物體來說，基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術(shù)能夠真實地反映基因組DNA上的遺傳信息，進而比較全面地揭示基因組的復雜性和多樣性，因而在生命科學研究中扮演了十分重要的角色。1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技術(shù)的誕生。盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進入21世紀后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標志的第二代測序技術(shù)誕生了。1.3第2代測序技術(shù)的特點速度快準確度高成本低覆蓋度深產(chǎn)出巨大1.4第2代測序技術(shù)的原理第2代測序技術(shù)包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。下面對三種第二代測序技術(shù)的原理和特點分別進行具體介紹。圖1.454測序技術(shù)流程454技術(shù)的主要缺點是無法準確測量同聚物(homopolymer)的長度。例如當待測序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測序反應中會一次加上多個T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號的強度來推測，有可能造成結(jié)果不準確。也正是因為這個原因，454技術(shù)主要的錯誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于較長的讀取長度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準確。圖2.Solexa測序技術(shù)流程Solexa技術(shù)的讀取長度可以達到2×75bp，相比454技術(shù)，其后續(xù)的序列拼接工作的計算量和難度均大大增加。Solexa技術(shù)主要的錯誤來源是核苷酸的替換，而不是插入或缺失，目前它的錯誤率大約在1-1.5%之間。Solexa技術(shù)每個循環(huán)能獲得20.5-25Gb的測序結(jié)果，耗時約9.5天。Solexa技術(shù)在合成中每次只能添加一個dNTP，因此很好地解決了同聚物長度的準確測量問題。圖3.SOLiD測序技術(shù)流程SOLiD技術(shù)與Solexa技術(shù)類似，后續(xù)的序列拼接工作也比較復雜。SOLiD技術(shù)每個循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為10-15Gb，耗時約為6-7天。SOLiD技術(shù)每個循環(huán)可以測兩個上樣玻片，讀取長度可達2×50bp，而且由于采用兩堿基測序，該技術(shù)的準確率能達到99.94%以上。1.5第2代測序技術(shù)的應用高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實驗步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差。依靠后期強大的生物信息學分析能力，對照一個參比基因組(referencegenome)高通量測序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測序(re-sequence)。2007年VanOrsouw等人結(jié)合改進的AFLP技術(shù)和454測序技術(shù)對玉米基因組進行了重測序，所發(fā)現(xiàn)的超過75%的SNP位點能夠用SNPWave技術(shù)驗證，提供了一條對復雜基因組特別是含有高度重復序列的植物基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)路線。2008年Hillier對線蟲CB4858品系進行Solexa重測序，尋找線蟲基因組中的SNP位點和單位點的缺失或擴增。2008年Mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進行了RNA深度測序。分析測得的序列，有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報道過的RNA剪切形式、3’端非翻譯區(qū)、變動的啟動子區(qū)域以及潛在的小RNA前體。而這些信息無論使用芯片技術(shù)還是SAGE文庫測序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。高通量測序技術(shù)在全基因組mRNA表達譜，microRNA表達譜，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應用。高通量測序另一個被廣泛應用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測小分子時遇到的技術(shù)難題(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據(jù)“不浪費”，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子RNA。在線蟲中獲得了40萬個序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了18個新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA。

在DNA—蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀—深度測序(ChIP-seq)實驗也展示了其非常大的潛力。染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA直接進行測序，對比refseq可以直接獲得蛋白與DNA結(jié)合的位點信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以檢測更小的結(jié)合區(qū)段、未知的結(jié)合位點、結(jié)合位點內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。1.6第2代測序技術(shù)的前景大多分析家都無法相信新一代測序技術(shù)能完全取代目前的芯片測序技術(shù)。新一代測序儀推廣困難可能由其價格昂貴導致。但是，基因芯片也有其自身的缺點，就在于它是一個“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)。而高通量測序的強項，就在于它是一個“開放系統(tǒng)”，它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。新一代測序技術(shù)相對傳統(tǒng)芯片測序技術(shù)的優(yōu)勢，最終還得依靠廣告和市場營銷手段的推廣才能獲得大眾的認可。近期出現(xiàn)的Helicos