酶學(xué)及酶工程課3章2節(jié)

酶學(xué)及酶工程EnzymologyandEnzymeEngineering田維熙教授中國科學(xué)院研究生院第三章酶的結(jié)構(gòu)與功能第二節(jié)酶的溶液構(gòu)象測定一、多維核磁共振（NMR)技術(shù)多維NMR是測定溶液蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的方法。1971年比利時(shí)Jeener首次提出二維核磁共振概念。80年代末開始以二維異核核磁共振測定13C，15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)。90年代Bax等提出異核三維和四維核磁共振方法?，F(xiàn)精度可達(dá)2埃分辨率。多維核磁共振的基本原理NMR是以自旋量子數(shù)I=1/2的1H，13C，15N等原子的核為探針，檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。在外加靜磁場（H0）作用下，自旋量子數(shù)不為0的原子核發(fā)生能級(jí)分裂。當(dāng)同時(shí)將射頻磁場H1作用其上，如頻率滿足關(guān)系式：ω＝γH0時(shí)，原子核吸收射頻磁場能量由低能級(jí)躍遷到高能級(jí)，稱核磁共振現(xiàn)象。其中γ為旋磁比，不同原子核的旋磁比不同，共振頻率不同，而有氫譜，碳譜，氮譜之分。多維核磁共振的基本原理在多維NMR實(shí)驗(yàn)中是以一串特定時(shí)間間隔的90°，180°……等脈沖方式將H1作用到蛋白質(zhì)樣品上。90°脈沖作用期間滿足共振頻率條件時(shí)，原子核吸收射頻磁場能量。脈沖關(guān)閉后弛豫機(jī)制使核由高能態(tài)回到平衡態(tài)，垂直方向接受線圈會(huì)感應(yīng)出高頻衰減信號(hào)，檢波后再經(jīng)傅立葉變換，形成核磁共振波譜。其中包含豐富的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)有關(guān)信息，可以正確地測定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)折疊。波譜參數(shù)：1）化學(xué)位移譜線化學(xué)位移來自于核外電子屏蔽作用。以系數(shù)σ描述所受屏蔽，共振條件公式變?yōu)椋害兀溅茫?－σ）H0，σ與分子結(jié)構(gòu)及原子核所處化學(xué)環(huán)境有關(guān)。同一類氨基酸中1H，15N和13C位于不同二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)折疊中時(shí)，其譜線產(chǎn)生相應(yīng)的化學(xué)位移。所以它們共振波譜的化學(xué)位移反映了蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)及局部微環(huán)境?；瘜W(xué)位移相對(duì)無規(guī)卷曲，α螺旋中α質(zhì)子化學(xué)位移向高場方向偏移0.39（標(biāo)為＋1），β折疊中α質(zhì)子化學(xué)位移向低場方向偏移0.37（標(biāo)為－1）。根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)中α質(zhì)子＋1或－1密集情況可推斷α螺旋和β折疊域。13C化學(xué)位移也有類似情況。綜合1Hα，13Cα，13Cβ和13C’等4組化學(xué)位移情況，可較明確判斷α螺旋和β折疊，正確率可達(dá)92％。波譜信息：2）J耦合常數(shù)核磁距通過電子云間接傳遞作用產(chǎn)生能量耦合，反映被測核與周圍原子核之間通過成鍵電子傳遞的磁相互作用。該耦合改變被測核共振條件，使譜線分裂為多重峰。譜線各分量距離表示耦合的強(qiáng)弱，定義為J耦合常數(shù)(Hz)。J耦合常數(shù)可用來描述蛋白質(zhì)主鏈及側(cè)鏈的構(gòu)象。鄰位質(zhì)子的耦合常數(shù)還與核扭轉(zhuǎn)角有關(guān)。Karplus方程給出主鏈和側(cè)鏈各鍵的二面角與J耦合常數(shù)關(guān)系，由J耦合常數(shù)數(shù)據(jù)可計(jì)算各二面角及扭轉(zhuǎn)角，從而給出相應(yīng)構(gòu)象。肽鍵中異核單鍵耦合常數(shù)波譜信息：3）NOENOE，即歐沃豪斯效應(yīng)，反映原子核自旋之間的偶極-偶極相互作用。蛋白質(zhì)分子中1H-1H距離小于5?，核磁共振氫譜中就可觀察到NOE信號(hào)，強(qiáng)度和質(zhì)子間距離6次方成反比。所以NOE信號(hào)強(qiáng)度提供了蛋白質(zhì)中氫原子對(duì)之間的距離信息。

NOE各二級(jí)結(jié)構(gòu)給出的NOE信號(hào)具有不同特征。α螺旋相鄰殘基的酰胺質(zhì)子間產(chǎn)生強(qiáng)NOE，酰胺氫和α氫、β氫之間產(chǎn)生不同強(qiáng)度的NOE，氫鍵產(chǎn)生弱NOE。反平行折疊中，相鄰酰胺氫和α氫產(chǎn)生強(qiáng)NOE，酰胺氫之間產(chǎn)生弱NOE，反向鏈酰胺氫之間，與α氫之間等產(chǎn)生中NOE，而平行折疊中NOE信號(hào)的出現(xiàn)規(guī)律又不相同。該信號(hào)可給出豐富信息。多維核磁共振實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)分子量的增加造成共振波譜加寬和重疊，無法提取結(jié)構(gòu)信息。多維核磁共振克服了該困難，提供了多種有效獲得結(jié)構(gòu)信息的實(shí)驗(yàn)。多維NMR共振信號(hào)是多個(gè)頻率變量的函數(shù)，可有二維、三維或四維頻率坐標(biāo)軸。實(shí)驗(yàn)中由專門設(shè)置的射頻脈沖序列作用，耦合的核發(fā)生磁化強(qiáng)度轉(zhuǎn)移或耦合相互作用而交換信息，用以建立化學(xué)位移，J耦合常數(shù)及NOE相關(guān)的信息。脈沖序列包括弛豫延遲時(shí)間、準(zhǔn)備周期、演化周期、混合周期、檢測周期，多次重復(fù)。核磁化轉(zhuǎn)移機(jī)制1）磁化強(qiáng)度相干轉(zhuǎn)移：耦合核之間通過成鍵電子傳遞磁化強(qiáng)度而交換信息。2）磁化強(qiáng)度非相干轉(zhuǎn)移：核之間通過空間的偶極相互作用而交換信息。多維核磁共振方法中，大多數(shù)脈沖序列基于磁化強(qiáng)度相干轉(zhuǎn)移，建立1H，13C，15N之間化學(xué)位移相關(guān)和J耦合常數(shù)信息。少數(shù)脈沖序列基于磁化強(qiáng)度非相干轉(zhuǎn)移而建立NOE相關(guān)。二維同核（1H-1H）COSY實(shí)驗(yàn)基于磁化強(qiáng)度相干轉(zhuǎn)移機(jī)制。弛豫延遲時(shí)間使氫核自旋回到熱平衡態(tài)(Ix)；準(zhǔn)備周期（第一個(gè)脈沖）置其非平衡態(tài)(-Iy)；演化周期按設(shè)置的間隔時(shí)間順序遞增，不同的氫核以不同頻率共振而有不同的化學(xué)位移標(biāo)記；混合周期（第二個(gè)脈沖）內(nèi)不同氫核自旋間產(chǎn)生相干轉(zhuǎn)移；在檢測周期測得自由衰減信號(hào)FID，經(jīng)傅立葉變換得到共振波譜。二維同核（1H-1H）COSY實(shí)驗(yàn)二維異核（1H-13C，1H-15N）HMQC實(shí)驗(yàn)分子量增加時(shí)同核實(shí)驗(yàn)靈敏度急劇下降，采用異核實(shí)驗(yàn)解決。本實(shí)驗(yàn)也基于磁化強(qiáng)度相干轉(zhuǎn)移機(jī)制。氫通道180脈沖使氫核化學(xué)位移聚焦并消除異核間J耦合。異核通道90脈沖使單量子項(xiàng)轉(zhuǎn)化為雙量子項(xiàng)，演化周期內(nèi)帶有異核化學(xué)位移標(biāo)記。經(jīng)再一個(gè)弛豫延遲時(shí)間后在檢測周期得到被異核化學(xué)位移調(diào)制的FID信號(hào)，經(jīng)二維傅立葉變換得到二維異核相關(guān)譜。二維異核（1H-13C，1H-15N）HMQC實(shí)驗(yàn)多維核磁共振實(shí)驗(yàn)已有多種二維脈沖序列：二維同核序列有COSY,TOCSY,RELAY,NOESY,E.COSY,P.E.COSY等;二維異核序列有HMQC,HMQC-COSY,HMQC-TOCSY,HMBC,HMQC-NOE,HMQCJ等。三維核磁共振實(shí)驗(yàn)的脈沖序列由兩個(gè)二維實(shí)驗(yàn)脈沖序列組合而成。實(shí)驗(yàn)中氫核及氮核的自旋演化周期分別獨(dú)立設(shè)置時(shí)間間隔遞增?？梢韵S波譜中由于兼并造成的交叉峰重疊現(xiàn)象。四維波譜又可克服三維波譜中的交叉峰重疊。三維核磁共振實(shí)驗(yàn)多種三、四維脈沖序列1）建立化學(xué)位移相關(guān)的序列，包括建立主鏈原子核間，側(cè)鏈原子核間核主、側(cè)鏈核間信號(hào)聯(lián)系的三類序列。2）產(chǎn)生質(zhì)子對(duì)間NOE相關(guān)的序列。3）提供同核或異核J耦合常數(shù)的序列。由多類實(shí)驗(yàn)提取各種所需信息，再對(duì)共振波譜解析，最終得到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整信息。波譜解析：1）序列識(shí)別由多維核磁共振波譜提取蛋白質(zhì)信息，從分析二維平面波譜開始。一個(gè)1萬分子量的蛋白質(zhì)，即可產(chǎn)生數(shù)百上千個(gè)核磁共振交叉峰，首先必須確認(rèn)它們的歸屬，稱為共振交叉峰的序列識(shí)別。首先確定同核化學(xué)位移譜中每一峰所屬的氨基酸及哪一質(zhì)子；然后根據(jù)NOE峰信息綜合分析，如找到連續(xù)的NOE和COSY交叉峰連線，就可判斷其序列位置。序列識(shí)別波譜解析：2）立體定向指認(rèn)對(duì)側(cè)鏈甲基和亞甲基質(zhì)子共振立體定向的指認(rèn)，使提高局部結(jié)構(gòu)測定精度的關(guān)鍵。根據(jù)J耦合常數(shù)值和NOE信號(hào)強(qiáng)弱可對(duì)亞甲基兩個(gè)氫立體定向構(gòu)象作判斷。分子量較大時(shí)則用特定的三維脈沖程序的交叉峰強(qiáng)弱估計(jì)亞甲基氫的定向。分子量較小的蛋白質(zhì)的甲基立體定向可用類似的方法指認(rèn)。對(duì)分子量大的蛋白質(zhì)需借助一些專門的方法。亞甲基立體定向指認(rèn)兩個(gè)β亞甲基氫的空間去向有3種主要旋轉(zhuǎn)異構(gòu)，其J常數(shù)值及NOE信號(hào)強(qiáng)弱如下構(gòu)象123Jαβ23.43.412.9Jαβ33.412.93.4NOE(αβ3)強(qiáng)弱強(qiáng)

NOE(αβ2)強(qiáng)強(qiáng)弱NOE(Nβ3)強(qiáng)強(qiáng)弱NOE(Nβ2)弱強(qiáng)強(qiáng)亮氨酸甲基立體定向指認(rèn)波譜解析：3）NOE交叉峰強(qiáng)度正確測定質(zhì)子間自旋擴(kuò)散和交叉峰重疊會(huì)提供不正確NOE信號(hào)強(qiáng)度。用高維NOE核磁共振實(shí)驗(yàn)消除NOE交叉峰重疊現(xiàn)象。在NOE實(shí)驗(yàn)脈沖程序中合理設(shè)定相關(guān)的混合時(shí)間有助于緩解自旋擴(kuò)散問題。NOE交叉峰強(qiáng)度可由積