冰凍切片漂片

免疫熒光操作步驟（漂片，冰凍切片）免疫組化步驟：將腦片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗說(shuō)明書(shū)，加3%雙氧水封閉10min（如果是從切片保護(hù)液取出，則要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步驟有差別），本實(shí)驗(yàn)室使用的二抗試劑盒為中杉金橋超敏二步法試劑盒；吸去雙氧水，PBS洗兩遍，將腦片周?chē)乃梦埢蛐l(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片；然后按照一抗說(shuō)明書(shū)，將一抗按比例稀釋?zhuān)尤胂♂尯蟮囊豢?，一般，大鼠腦片一張需 50微升一抗稀釋液，小鼠腦片為30微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；然后，4C,過(guò)夜（18h或者24h），不建議使用37C；然后，PBS洗凈兩遍；剩下步驟見(jiàn)二抗試劑盒說(shuō)明書(shū)。DAB配方為：lOmgDAB固體加到20ml0.01MPBS，臨用時(shí)加100-200微升30%雙氧水，注意避光。顯色10min，看片子染色深淺情況適當(dāng)調(diào)整顯色時(shí)間。一般 3分鐘顯色就比較明顯，如果20分鐘仍未顯色，則看下面的參考。然后PBS洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片，自然晾干。干燥天氣 2-3h，潮濕天氣3-4h。脫水：70%酒精3min,95%酒精3min,100%酒精3min,100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上鹽分較多，在70%酒精前在雙蒸水1min。免疫熒光步驟及注意事項(xiàng)：將腦片放到6空板的山羊血清封閉液中，封閉 20-40min;（如果是從切片保護(hù)液取出，則要用 PBS洗一遍）吸去山羊血清，PBS洗兩遍，將腦片周?chē)乃梦埢蛐l(wèi)生紙擦凈，注意不要碰到腦片；然后按照一抗說(shuō)明書(shū)，將一抗按比例稀釋?zhuān)尤?PBS稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需 50微升一抗稀釋液，小鼠腦片為30微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上,要重新加或者加大量,使腦片完全浸入液體；4C,過(guò)夜（18h或者24h），不建議使用37C，如果熒光亮度不強(qiáng)，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間到 48或72小時(shí)；然后，PBS洗凈兩一一三遍，按照二抗說(shuō)明書(shū)稀釋的熒光二抗，室溫孵育 2小時(shí)。注意避光操作。0.01MPBS洗兩遍，轉(zhuǎn)移到載玻片上，避光自然晾干；滴加防淬滅劑后,蓋上蓋玻片鏡下觀察。常見(jiàn)問(wèn)題：熒光太暗：可能蛋白表達(dá)少；可能一抗孵育時(shí)間短；二抗孵育時(shí)間短；清洗次數(shù)過(guò)多；溶液 pH不合適；熒光萃滅；一抗?jié)舛冗^(guò)低或過(guò)高；二抗?jié)舛冗^(guò)低或過(guò)高；激發(fā)波長(zhǎng)不在抗體適用波段。背景熒光太深：一抗?jié)舛冗^(guò)高,清洗不徹底；二抗?jié)舛冗^(guò)高,清洗不徹底；封閉時(shí)間過(guò)短,非特異性過(guò)強(qiáng)；一抗非特異性過(guò)強(qiáng)；二抗非特異性過(guò)強(qiáng)；顯微鏡熒光強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)?？傊畬?shí)驗(yàn)是喜歡強(qiáng)陽(yáng)性,不喜歡假陰性,呵呵。任何實(shí)驗(yàn)都需要花時(shí)間摸索才能找到其最佳的工作條件。另附免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題解析。原理是相同的,只是最后的顯色方法不一樣,有些問(wèn)題有啟發(fā)作用。免疫組織化學(xué)邊緣效應(yīng)?原因:1）組織邊緣與玻片粘貼不牢,邊緣組織松脫漂浮在液體中,每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致 .解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴(lài)氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于 4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織,邊緣的試劑容易首先變干,濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織,應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí),為了避免油劑的影響,畫(huà)圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。解決辦法:這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織）,需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或 SP孵育之后的浸洗尤為重要；標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強(qiáng)非特異性著色。免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？1、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的工作液，怎么這么高稀釋度也沒(méi)能做出陽(yáng)性結(jié)果？另外不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。2、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合 ;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。3、組織切片本身這種抗原含量低；4、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。5、 DAB孵育時(shí)間過(guò)短。6、 細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。7、開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。背景強(qiáng)的原因？1,考慮一抗?jié)舛雀撸?,然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；3,也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等。DAB顯色真的需要3-10分鐘嗎？我之前做的顯色40秒就夠了，再多本底就太深，現(xiàn)在做另一個(gè)顯色3分鐘也不出，真的有必要延長(zhǎng)顯色時(shí)間嗎？DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗4度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？，1烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(zhǎng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度二，用含有多聚賴(lài)氨酸的玻片，可以購(gòu)買(mǎi)到或這自己做三，有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖 PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織，四，用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。年前爬的細(xì)胞片在-20度放了半年（保鮮膜密封），現(xiàn)在取出來(lái)再作，做了兩次，步驟均是按以前的作的，但今天做時(shí)，原來(lái)顯色很強(qiáng)的片子現(xiàn)在顯色很弱了，問(wèn)什么呢？是不是片子放的時(shí)間太長(zhǎng)了？抗體在 4度放的時(shí)間也不長(zhǎng)而且這次濃度比以前做的還高?首先，抗體濃度和孵育時(shí)間在免疫組化中至關(guān)重要。在抗原抗體反應(yīng)并非抗體濃度越高，反應(yīng)越強(qiáng)烈，這叫前帶現(xiàn)象。所以選擇最佳的一抗?jié)舛群头跤龡l件也是十分重要的，其實(shí)抗體濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)引起陰性。我到認(rèn)為你這片子的影響可能更大。盡管在 -20度保存，但是時(shí)間一般超過(guò)3個(gè)月就不能保證其中抗原的丟失，建議可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。你說(shuō)抗體放在4度保存是指未稀釋還是稀釋后抗體，存放多長(zhǎng)時(shí)間？一般稀釋后抗體不能保存很長(zhǎng)時(shí)間的。為什么切片傾斜，抗體分布不均勻，就會(huì)造成一半陽(yáng)性，一半陰性？我認(rèn)為，即使切片傾斜，抗體覆蓋少的那部分組織和其他部分抗體的濃度是一樣的，只是抗體體積的大小差異！如果說(shuō)抗體傾斜沒(méi)覆蓋好的地方是陰性，那為什么不是干片所導(dǎo)致的非特異性高背景的染色呢？當(dāng)切片傾斜到有一半甚至都沒(méi)液體時(shí)， 就會(huì)出現(xiàn)陰陽(yáng)臉樣的著色。你認(rèn)為呢？9?高溫抗原修復(fù)后就沒(méi)必要滅火內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 ？經(jīng)過(guò)高溫POD已經(jīng)滅活了，不錯(cuò)POD是被被滅活了，但它仍有還原能力，仍能跟DAB發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使DAB顯色，我們用雙氧水是耗竭POD的還原能力，使之不能在跟DAB反應(yīng)。所以無(wú)論修復(fù)與否都應(yīng)該滅活 POD，盡可能消除非特異性著色。冰凍切片有時(shí)會(huì)有小洞?冰凍切片有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)切片上會(huì)有空洞，這是因?yàn)榻M織在冰凍過(guò)程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是組織冰凍時(shí)間太慢，或者冰凍的溫度不夠低，慢慢形成冰晶，二是有些組織在冰凍之前需要做適當(dāng)?shù)墓潭?，如腦組織，然后放入30%的蔗糖4度冰箱過(guò)夜以減少冰晶形成，并且能最大程度保持組織細(xì)胞形態(tài)。另外在切片是組織塊復(fù)溫要在37度速融，否則易造成組織塊的破壞。常用免疫組化結(jié)果分析方法?陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組 3~6張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可?；颐芏确治龇?。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 imagej進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。評(píng)分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（ 0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。對(duì)于以上這幾種方法，各有利弊，請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。DAB呈色后到底什么樣染色是特異性染色？陽(yáng)性標(biāo)記可以從色度特征，陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征來(lái)進(jìn)行基本的判斷。色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，標(biāo)記方法越敏感，陽(yáng)性結(jié)果顯色則越強(qiáng)。根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)記的顯色程度分為：淡黃色，提示為弱抗原；棕黃色，提示為中等度抗原；棕黑色，示為強(qiáng)抗原。在結(jié)果判斷中，后兩者較有意義，可作為判斷依據(jù)。細(xì)胞學(xué)特征：陽(yáng)性表達(dá)必須在細(xì)胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的陽(yáng)性表達(dá)即使陽(yáng)性也不應(yīng)作為判斷依據(jù)。一般分為胞膜型，胞核型，胞質(zhì)型，微絨毛型,復(fù)合型幾種。這是需要結(jié)合背景知識(shí)的。同樣，非特異性染色也有一定的特點(diǎn)：它首先是指抗原無(wú)明確定位，各種細(xì)胞累及一片，色度無(wú)深淺之分，這種標(biāo)記組織片不能作為免疫組織標(biāo)記結(jié)果判斷的依據(jù)，造成非選民性染色的原因常為組織標(biāo)本固定不佳，抗體質(zhì)量問(wèn)題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等。因此，免疫組化特異性染色定位非常重要，一般情況下，陽(yáng)性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相互交雜，陽(yáng)性染色強(qiáng)度深淺不一。如果缺乏細(xì)胞音的不均一性染色，即或呈陽(yáng)性染色，常提示為非特異性染色。另外，組織片邊緣反應(yīng)和出血壞死灶周?chē)?yáng)笥反應(yīng)不能作為診斷依據(jù)。13.1.石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？我用組織芯片和普通切片在多種條件下進(jìn)行了抗原修復(fù)實(shí)驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)在熱修復(fù)后，組織脫片最主要原因是組織脫水不良，腫瘤組織黏附性差在小塊組織時(shí)也容易撕脫（減小熱修復(fù)加熱功率，PBS沖中洗時(shí)不要直對(duì)組織沖洗、可以有效防范）。DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？這就是免疫組化染色的陰陽(yáng)臉，免疫組化實(shí)驗(yàn)是環(huán)環(huán)相扣的實(shí)驗(yàn)，任何一步試劑孵育不全（沒(méi)有均勻的在組織上孵育）都可能導(dǎo)致這樣的結(jié)果。免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果？那就要考慮真陰性還是假陰性！假陰性是你操作不當(dāng)或者試劑質(zhì)量的問(wèn)題了。切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？你的抗體是否特異，孵育時(shí)間溫度濃度是否過(guò)長(zhǎng)！一抗從4度拿出后，為什么有人說(shuō)要37度復(fù)溫，目的是什么？我沒(méi)遇到這樣的說(shuō)法，是否是想加速?gòu)?fù)溫？還有我不知道國(guó)內(nèi)的院校為什么對(duì)37C孵育如此感興趣，在你們買(mǎi)國(guó)外抗體時(shí)，他們的說(shuō)明書(shū)上除了酶修復(fù)要37C外，其他步驟中均沒(méi)有說(shuō)要在37C中孵育。免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？尤其微波修復(fù)。抗原修復(fù)沒(méi)有什么最佳條件只有可能管用的修復(fù)條件。有人在一抗孵育前用tritonX100來(lái)通透細(xì)胞，對(duì)石蠟切片需要否？tritonX100是脂質(zhì)溶解劑，做免疫細(xì)胞化學(xué)時(shí)細(xì)胞膜是完整的半透膜，孵育的抗體要自由的通過(guò)細(xì)胞膜就要用tritonX100來(lái)破膜。石蠟切片細(xì)胞多數(shù)是切開(kāi)狀態(tài)了。但是脂質(zhì)有時(shí)會(huì)吸附抗體，含脂質(zhì)高的組織也可以用triton。蘇木素復(fù)染的時(shí)間應(yīng)該是多少？復(fù)染過(guò)度咋辦？要看你是用什么蘇木素，免疫組化復(fù)染，不比我們平常的 HE,它只要一般的輕微染色就