實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 浙科版選修一

微生物微生物(microorganism)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物。例：酵母、霉菌、細(xì)菌、放線菌、病毒和小型原生動(dòng)物等等微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理……歷史小資料

19世紀(jì)中期，關(guān)系到法國(guó)經(jīng)濟(jì)命脈的釀造業(yè)曾一度遭受毀滅性的打擊。在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經(jīng)過一番研究，法國(guó)科學(xué)家巴斯德發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。

保持培養(yǎng)物純凈，保證無雜菌污染很重要！大腸桿菌的培養(yǎng)與分離一、大腸桿菌（E.coli）兼性厭氧的腸道內(nèi)的共生菌群合成維生素B和維生素K，供機(jī)體利用；產(chǎn)生大腸桿菌素，抑制腸道致病菌和腐生菌滋生。革蘭氏陰性菌作為一種工程菌，在基因工程技術(shù)中被廣泛采用。例：大規(guī)模生產(chǎn)治療糖尿病的藥物——胰島素培養(yǎng)基（culturemedia）

按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出的供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。提供微生物生長(zhǎng)的條件：合適的溫度：25-37℃合適的pH：細(xì)菌6.5-7.5中性偏堿真菌5.0-6.0中性偏酸營(yíng)養(yǎng)成分：含有碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、水和無機(jī)鹽。關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也能提供能量

DLB培養(yǎng)基的配方固體培養(yǎng)基的配制：每50ml液體培養(yǎng)基添加1g瓊脂瓊脂？紅藻中提取的多糖,在98℃以上熔化，44℃以下凝固，常溫下凝結(jié)成有彈性的凝膠。凝固劑培養(yǎng)基種類

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型固體培養(yǎng)基：菌落液體培養(yǎng)基：表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)半固體培養(yǎng)基：無動(dòng)力有動(dòng)力(彌散)4.培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：增菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種半固體培養(yǎng)基：動(dòng)力檢測(cè)培養(yǎng)基的分類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基（抑制不需要的微生物生長(zhǎng)）酵母菌、霉菌——青霉素金黃色葡萄球菌——高濃度食鹽鑒別培養(yǎng)基大腸桿菌——伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基物理性質(zhì)培養(yǎng)基用途．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前

B一、無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。1）無菌操作：各種器皿必需是無菌的各種培養(yǎng)基必需是無菌的接種時(shí)不能帶入其他雜菌（１）消毒：指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌：以物理或化學(xué)方法消滅所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體，芽孢等，而達(dá)到完全無菌的過程。芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。(3)消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法:

70-75℃下煮30min或80℃下煮15min。適用于如牛奶、啤酒、果酒、醬油等不宜進(jìn)行高溫滅菌的液體3、用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒4、氯氣消毒水源5、紫外線消毒：如接種室空氣……(4)常用滅菌的方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.4、不能加熱滅菌的化合物，如尿素（加熱會(huì)分解）：G6玻璃砂漏斗過濾（G6孔徑最小，細(xì)菌不能濾過）接種環(huán)1.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考題滅菌鍋檢查水位設(shè)定高壓溫度及時(shí)間，121℃20min放入待滅菌物品加熱，并打開放氣閥排冷空氣關(guān)閉放氣閥繼續(xù)升溫升壓待溫度降低至80℃以下開蓋，取出物品烘干無菌技術(shù)操作要點(diǎn)1、實(shí)驗(yàn)操作空間,操作者的衣著和手——2、微生物培養(yǎng)的器皿用具和培養(yǎng)基等——3、為避免周圍環(huán)境中的微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在進(jìn)行。4、實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸?！鍧嵑拖緶缇凭珶艋鹧娓浇⑸飳?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序培養(yǎng)基配制器具和培養(yǎng)基滅菌倒平板微生物接種（斜面→液體）恒溫箱中培養(yǎng)分離純化（液體→平板劃線）培養(yǎng)，菌種的保存（斜面）準(zhǔn)備階段培養(yǎng)階段準(zhǔn)備階段LB培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）1．稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞、加封口膜7．包扎8．滅菌9．倒平板10．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。稱量蛋白胨酵母提取物NaCl液體LB培養(yǎng)基的配方

固體LB培養(yǎng)基每100ml液體LB培養(yǎng)基中加入2g瓊脂，搖勻，滅菌。滅菌培養(yǎng)皿壁上不能沾有培養(yǎng)皿，否則容易污染。

1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，為什么要將平板倒置？

答：恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿會(huì)是水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放培養(yǎng)皿，則水分形成的水滴回落到培養(yǎng)基的表面并且散開。如果培養(yǎng)皿已形成菌落，則菌落中的菌會(huì)隨水?dāng)U散，菌落相互影響，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離的目的。因此，恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿必須倒置。小結(jié)1什么是微生物？有哪些應(yīng)用？2培養(yǎng)基的基本營(yíng)養(yǎng)成分及其配制方法3無菌技術(shù)：消毒和滅菌（高壓蒸汽滅菌法）4微生物培養(yǎng)的基本程序（倒平板技術(shù)）

微生物在自然界中呈混雜狀態(tài)存在，要獲得所需菌種，必須從中進(jìn)行分離。在保藏菌種時(shí)不慎污染時(shí)也需予以分離。怎樣純化分離我們需要的大腸桿菌呢？