心肌組織病理學(xué)評(píng)價(jià)心肌內(nèi)固定治療大鼠心肌梗死模型的建立

心肌組織病理學(xué)評(píng)價(jià)心肌內(nèi)固定治療大鼠心肌梗死模型的建立

為研究缺血性心肌病提供了可能的方法。在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)方法并確保實(shí)驗(yàn)正常時(shí)，選擇合適的檢測(cè)方法非常重要。我們必須了解與心臟疾病相關(guān)的肌腱和血管再生，并具有組織病理學(xué)檢查的要求。然而，如果我們想知道這對(duì)肝功能的影響，我們需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。本研究通過結(jié)扎左冠脈前降支的方法,建立穩(wěn)定的大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型,并于結(jié)扎前后利用MPA多導(dǎo)生理記錄儀描記心電圖,4周后進(jìn)行離體Langendorff心臟灌流測(cè)定左室心功能和心肌組織病理學(xué)檢查,評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建情況,為研究干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死后的心功能變化提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境成年Sprague_Dawley(SD)大鼠,雌雄不限,體重為(350±50)g[合格證號(hào):SCXK(滬)2003-0002],購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)[飼養(yǎng)設(shè)備:SYXK(滬):2004-0005],上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本研究遵循國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例及國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則。1.2呼吸頻率的確定模型組選用SD大鼠16只,用氯胺酮腹腔注射麻醉后,先行氣管切開插管并接通微型動(dòng)物呼吸機(jī)(第二軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)研究所生產(chǎn),江灣Ⅰ型),待呼吸機(jī)參數(shù)調(diào)整好后(呼吸頻率每分鐘110~120次,吸與呼之比為1∶1.5),在胸骨左側(cè)4、5肋間開胸,顯露左冠動(dòng)脈前降支,于其中遠(yuǎn)段1/3交點(diǎn)處(從前降支的起始到心尖部拉一細(xì)線,三折后確定中遠(yuǎn)1/3交點(diǎn)),以8~0proline線直接結(jié)扎,進(jìn)針深度0.2~0.4mm。逐層關(guān)胸,清醒后拔除氣管插管,送回動(dòng)物房精心飼養(yǎng)4周。另選僅開關(guān)胸后存活的10只SD大鼠作為對(duì)照組。1.3評(píng)估方法1.3.1病理組織學(xué)檢測(cè)將3根電極分別置于兩上肢和右下肢,接MPA多導(dǎo)生理記錄儀(上海奧爾科特生物科技有限公司)系統(tǒng),在冠脈結(jié)扎前至冠脈結(jié)扎后連續(xù)描記心電圖。于4周后開胸經(jīng)下腔靜脈注入肝素(0.5mg/kg),剪斷上下腔靜脈、肺動(dòng)脈、主動(dòng)脈(保留1cm左右)及心臟周圍組織,迅速取出心臟置于4℃的Krebs_Henseleit(K_H)灌流液(NaCl118.0mmol/L、KCl4.7mmol/L、KH2PO41.2mmol/L、MgSO4·7H2O1.2mmol/L、CaCl22.9mmol/L、NaHCO32.5mmol/L、Glicose11.1mmol/L、EDTA0.5mmol/L,pH7.38~7.46)中,輕輕擠壓心臟,排空心臟內(nèi)殘留的血液,立即將主動(dòng)脈固定于Langendorff灌流裝置(上海奧爾科特生物科技有限公司)插管固定器上的一個(gè)插管上,經(jīng)三通開關(guān)接K_H灌流液,灌流液以95%O2和5%CO2充分飽和、灌流壓約7.9Kpa左右、灌流液溫度為35℃~37℃左右。從左室插入尖端帶有水囊的導(dǎo)管,然后通過壓力傳感器,接MPA系統(tǒng)記錄左心室最大收縮壓峰值(LVPSP)和左室舒張末壓峰值(LVEDP)、左室內(nèi)壓等容相最大上升及下降速率(+dp/dtmax,_dp/dtmax)。1.3.2病理組織切下完成離體心臟指標(biāo)的檢測(cè)后,迅速取下心臟,進(jìn)行心肌組織的病理學(xué)檢查,觀察梗死區(qū)域的病理變化(由專業(yè)人員完成)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用SAS8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組采用組間t檢驗(yàn),差異顯著性水平設(shè)為a=0.05或者0.01。2結(jié)果2.1兩種類型的呼吸感染造成患者呼吸衰竭,是造成呼吸嚴(yán)重?fù)p害的例數(shù),是造成呼吸被傷害時(shí)造成呼吸阻力;術(shù)后肺部感染導(dǎo)致呼吸感染本此實(shí)驗(yàn)的麻醉效果好,術(shù)中呼吸道分泌物少且無麻醉意外發(fā)生。呼吸參數(shù)設(shè)定合適、呼吸機(jī)性能穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)造模成功率為62.50%(10/16),由于不明原因的竇性停搏及室性心動(dòng)過速致使心臟停跳而死亡2只,術(shù)中引起肺部損傷、氣管切開出現(xiàn)的凝血塊及分泌物引起呼吸道梗阻等導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡的例數(shù)為3只,而術(shù)后肺部感染導(dǎo)致的死亡例數(shù)為1只。因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型手術(shù)操作是在心臟不停跳的情況下進(jìn)行冠脈結(jié)扎,易造成心臟損傷,對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷較大,嚴(yán)格的無菌操作和熟練的手術(shù)技能可減少動(dòng)物的死亡率。2.2心電圖標(biāo)志的建立心電圖檢測(cè)以兩個(gè)以上導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段呈持續(xù)性抬高、降低、至出現(xiàn)病理性Q波為模型建立成功的心電圖標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)扎前呈正常心電圖表現(xiàn)(圖1),打結(jié)后可見左室前壁及心尖部顏色變暗、搏動(dòng)減弱,此時(shí)即出現(xiàn)ST_T融合波抬高;在結(jié)扎30min后可觀察到病理性Q波的出現(xiàn)(圖2),提示心肌梗死模型制作成功。2.3兩組hr、dp、dtx、lvedp對(duì)比表1所示Langendorff離體心臟灌流裝置系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組的LVSP(t=3.6550,df=18.0,P=0.0018)、+dp/dtmax(t=_2.6816,df=18.0,P=0.0152)與_dp/dtmax(t=2.9394,df=18.0,P=0.0088)降低;LVEDP(t=4.4574,df=18.0,P=0.0003)升高,兩組相比差異極顯著;而兩組HR差異不顯著(t=0.4261,df=18.0,P=0.6751)。提示大鼠心肌梗死模型建立成功4周后左室心功能顯著下降。2.4纖維組織化常規(guī)HE染色后,在顯微鏡下觀察可見心內(nèi)膜下存活心肌細(xì)胞島狀分布,心肌纖維排列紊亂,心內(nèi)膜下纖維肉芽組織增生,壞死心肌被纖維組織取代(圖3,見后插頁Ⅰ)。3離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在分子生物學(xué)、病理生理學(xué)和細(xì)胞學(xué)等方面為心血管疾病的診治提供了豐富的參考資料,轉(zhuǎn)基因技術(shù)和組織工程學(xué)的發(fā)展使動(dòng)物模型能夠用于進(jìn)一步的疾病機(jī)制和技術(shù)的探索,而大鼠作為研究心血管疾病的動(dòng)物模型已得到公認(rèn)。急性心肌梗死后,一部分心肌細(xì)胞壞死,一部分心肌缺血,活力降低,梗死相關(guān)冠狀動(dòng)脈再通后,由于大量的氧自由基等產(chǎn)物造成心肌缺血再灌注損傷。目前,有關(guān)干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死和缺血性心肌病所致的慢性心功能不全的基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)有報(bào)道,在改善心功能和減輕病理損傷方面都有一定的效果,為進(jìn)一步研究干細(xì)胞移植的治療機(jī)制和近、遠(yuǎn)期療效,必需有一個(gè)穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、且更有適用于測(cè)定其心功能變化的動(dòng)物模型。在體情況下,心臟功能受前后負(fù)荷及心率等的影響,且后者又受神經(jīng)體液的調(diào)控,因而很難準(zhǔn)確評(píng)價(jià)各種干預(yù)性措施對(duì)心臟功能的影響,離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)將動(dòng)物心臟取出,連接到特定的灌流裝置,用灌流液灌注,排除了神經(jīng)和體液的控制,配合特別為心功能研究設(shè)計(jì)的MPA心功能分析軟件記錄心室內(nèi)壓、動(dòng)脈血壓和心電信號(hào),自動(dòng)分析數(shù)十項(xiàng)參數(shù),用于病理生理情況下的心功能與血流動(dòng)力學(xué)改變等研究,在生理、病理生理以及藥理學(xué)研究中已得到廣泛地應(yīng)用,大鼠離體灌流心臟模型是研究心肌收縮特性和心肌代謝的適宜方法。本研究用結(jié)扎法建立大鼠心肌梗死模型,4周后采用Langendorff離體心臟灌流及其連接的MPA多導(dǎo)生理記錄儀對(duì)該模型的心功能進(jìn)行檢測(cè),為研究干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心肌梗死后的治療作用提供基礎(chǔ)。心肌梗死是一個(gè)冠脈結(jié)扎后心肌組織缺血程度逐步加重而導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死的病理過程,結(jié)扎冠脈后,由結(jié)扎冠脈直接供血的心肌很快死亡,而周圍組織可接受附近血管的血液供應(yīng),不會(huì)即刻壞死,但隨著缺血的加重梗死區(qū)逐步向外擴(kuò)展。一般情況下,缺血20~40min后心肌組織發(fā)生不可逆的損傷。在本實(shí)驗(yàn)中我們結(jié)扎左冠脈前降支30min后,心電監(jiān)測(cè)出現(xiàn)病理性Q波,說明模型構(gòu)建成功。本研究制作心肌梗死模型時(shí)采用的心臟原位結(jié)扎法,心臟處于正常解剖位置,對(duì)心臟生理功能影響較小,但視野小、操作困難、創(chuàng)傷較大,故選擇體重稍大、體質(zhì)健康者的動(dòng)物為宜;因?yàn)镾D大鼠對(duì)麻醉藥較為敏感,劑量稍高、注射稍快,易導(dǎo)致呼吸抑制而死亡,應(yīng)嚴(yán)格控制給藥劑量和速度;SD大鼠心臟對(duì)各種刺激均較為敏感,更易發(fā)生室顫而死亡,因此,術(shù)前給予利多卡因預(yù)防室顫;動(dòng)物死亡多發(fā)生在插管、結(jié)扎至拔管1h內(nèi),少數(shù)可發(fā)生在心肌梗塞后24h,操作需謹(jǐn)慎、細(xì)致和嚴(yán)密觀察,本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的存活率與國外文獻(xiàn)報(bào)道相似。4周后構(gòu)建適用