生物工業(yè)下游技術第七章反膠團萃取法

第七章反膠團萃取法

謝虹2023/10/82第一節(jié)概述

反膠團萃取

隨著基因工程和細胞工程的發(fā)展，盡管傳統(tǒng)的分離方法(如溶劑萃取技術)已在抗生素等物質的生產中廣泛應用，并顯示出優(yōu)良的分離性能，但它卻難以應用于蛋白質的提取和分離。2023/10/84其主要原因有兩個：一是被分離對象－蛋白質等在40-50℃便不穩(wěn)定，開始變性，而且絕大多數(shù)蛋白質都不溶于有機溶劑，若使蛋白質與有機溶劑接觸，也會引起蛋白質的變性；二是萃取劑問題，蛋白質分子表面帶有許多電荷，普通的離子締合型萃取劑很難奏效。因此研究和開發(fā)易于工業(yè)化的、高效的生化物質分離方法己成為當務之急。反膠束萃取法就是在這一背景下發(fā)展起來的一種新型分離技術。2023/10/85反膠團溶液的概念：反膠團溶液是透明的、熱力學穩(wěn)定的系統(tǒng)。反膠團是兩性表面活性劑分散于非極性有機相中親水性基團自發(fā)形成的內含微小水滴的、空間尺度僅為納米級的聚集體。所以表面活性劑是反膠束溶液形成的關鍵。反膠團萃取具有成本低、溶劑可反復使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的優(yōu)點；反膠團萃取還有可能解決外源蛋白的降解，即蛋白質(胞內酶)在非細胞環(huán)境中迅速失活的問題；由于構成反膠團的表面活性劑往往具有溶解細胞的能力，因此可用于直接從整細胞中提取蛋白質和酶。可見，反膠團萃取技術為蛋白質的分離提取開辟了一條具有工業(yè)開發(fā)前景的新途徑。優(yōu)點：2023/10/87第二節(jié)反膠團的形成

2023/10/88一、反膠團的構造

具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜功能；在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子保持活性功能。2023/10/89將表面活性劑溶于水中，當其濃度超過臨界膠團濃度(CMC)時，表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起而形成聚集體，在通常情況下，這種聚集體是水溶液中的膠團，稱為正常膠團(normalmicelle)。在膠團中，表面活性劑的排列方向是極性基團在外，與水接觸，非極性基團在內，形成一個非極性的核心、在此核心可以溶解非極性物質。2023/10/810若將表面活性劑溶于非極性的有機溶劑中，并使其濃度超過臨界膠團濃度(CMC)，便會在有機溶劑內形成聚集體，這種聚集體稱為反膠團，其結構示意見圖b。在反膠團中，表面活性劑的非極性基團在外與非極性的有機溶劑接觸，而極性基團則排列在內形成一個極性核(po1arcore)。2023/10/811此極性核具有溶解極性物質的能力，極性核溶解水后，就形成了“水池”(waterpool)。當含有此種反膠團的有機溶劑與蛋白質的水溶液接觸后，蛋白質及其他親水物質能夠通過螯合作用進入此“水池”。由于周圍水層和極性基團的保護，保持了蛋白質的天然構型，不會造成失活。蛋白質的溶解過程和溶解后的情況示意于圖中。2023/10/812bacC增溶、乳化、潤濕、殺菌、去污、起泡和消泡等二、表面活性劑（一）表面活性劑的概念

表面張力：一種使表面分子具有向內運動的趨勢，并使表面自動收縮至最小面積的力,現(xiàn)象見圖1。

表面活性：使液體表面張力下降的性質。

表面活性物質：能使液體表面張力下降的物質。

表面活性劑：具有很強的表面活性、能夠顯著降低液體表面張力的物質。圖1荷葉上的水珠的表面張力作用現(xiàn)象OOOOOOOOWWW（肥皂R——COO-）（二）結構特征親油的非極性烴鏈親水的極性基團雙親性分子結構長度不少于8個碳原子羧酸磺酸硫酸及其鹽或羥基酰胺基等（三）表面活性劑的分類陰離子表面活性劑陽離子表面活性劑兩性離子表面活性劑非離子表面活性劑1．陰離子表面活性劑（1）肥皂類通式（RCOO－）nMn+（2）硫酸化物通式ROSO3－M+（3）磺酸化物通式RSO3－M+堿金屬皂：O/W堿土金屬皂：W/O有機胺皂：三乙醇胺皂硫酸化蓖麻油、月桂醇硫酸鈉、十六烷基硫酸鈉等阿洛索-OT、十二烷基苯磺酸鈉、甘膽酸鈉等良好的乳化能力，但易被酸破壞，一般供外用乳化能力很強，較穩(wěn)定。主要用作外用軟膏的乳化劑滲透力強，去污力強，為優(yōu)良洗滌劑2．陽離子表面活性劑

3．兩性離子表面活性劑通式[RNH3]＋

X－主要有苯扎氯銨和苯扎溴銨（新潔爾滅）等。堿性水溶液中呈陰離子表面活性劑的性質，具有很好的起泡、去污作用；酸性溶液中則呈陽離子表面活性劑的性質，具有很強的殺菌能力。天然品卵磷脂合成品氨基酸型與甜菜堿型。脂肪酸甘油酯脂肪酸山梨坦（司盤、Span）聚山梨酯（吐溫、Tween)聚氧乙烯脂肪酸酯（賣澤、Myrij）聚氧乙烯脂肪醇醚（芐澤、Brij）聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物（泊洛沙姆、Poloxamer）商品名為普流羅尼克（Pluronic）

4．非離子表面活性劑主要用作W/O型輔助乳化劑HLB值：1.8～8.6W/O型乳化劑HLB值：﹥8增溶劑、潤濕劑、O/W型乳化劑HLB值較高，作增溶劑、O/W型乳化劑Poloxamer188系O/W型乳化劑，可用于靜脈乳劑

2023/10/820表面活性劑

表面活性劑是由親水憎油的極性基團和親油憎水的非極性基團兩部分組成的兩性分子，可分為陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子型表面活性劑，它們都可用于形成反膠團。常用的表面活性劑及相應的有機溶劑見表2023/10/821

在反膠束萃取蛋白質的研究中，用得最多的是陰離子表面活性劑AOT(AerosolOT)，其化學名為丁二酸－2－乙基己基酯磺酸鈉，結構式見圖2023/10/822

這種表面活性劑容易獲得，其特點是具有雙鏈，極性基團較小、形成反膠束時不需加助表面活性劑，并且所形成的反膠束較大，半徑為170nm，有利于大分子蛋白質進入。2023/10/823(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴常使用的陽離子表面活性劑名稱和結構如下：2023/10/824(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲銨2023/10/825(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲銨將陽離子表面活性劑如CTAB溶于有機溶劑形成反膠團時，與AOT不同，還需加入一定量的助溶劑(助表面活性劑)。這是因為它們在結構上的差異造成的。2023/10/826三、反膠團的物理化學特征及制備

1.反膠團的物理化學特征2023/10/827臨界膠團濃度(CriticalMicelleConcentrationCMC)臨界膠團濃度,是膠團形成時所需表面活性劑的最低濃度，用CMC來表示，這是體系特性，與表面活性劑的化學結構、溶劑、溫度和壓力等因素有關。CMC的數(shù)值可通過測定各種物理性質的突變(如表面張力、滲透壓等)來確定。由于實驗方法不同，所得的CMC值往往難于完全一致，但是突變點總是落在一個很窄的濃度范圍內，故用CMC范圍來表示更為方便。2023/10/828反膠團的含水率WW＝C水/C表W越大，表示反膠團的半徑越大。2023/10/8292.反膠團的制備注入法：將含有蛋白質的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性有機溶劑中，然后進行攪拌直到形成透明的溶液。過程快，較好的控制反膠團的直徑和含水量。相轉移法：將含有蛋白質的水相與含有表面活性劑的有機相接觸，在緩慢的攪拌一部分蛋白質轉入有機相。過程較慢，可在有機溶劑相中獲得較高的蛋白質溶液。溶解法：將含有反膠團的有機溶劑與蛋白質粉末一起攪拌，使蛋白質進入反膠團。對非水溶性蛋白質可用此法。2023/10/830第二節(jié)生理活性物質的分離濃縮

2023/10/831bacC是有機相—水相間的分配萃取，是從主體水相向溶解于有機溶劑相中納米級、均一且穩(wěn)定的、分散的反膠團微水相中的分配。2023/10/832bc特點：萃取進入有機相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，避免了與有機溶劑相直接接觸而引起的變性、失活；同時反膠團微水相體積最多僅占有機相的幾個百分點，是一個濃縮的過程。2023/10/833反膠團的溶解作用

由于反膠團內存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白質等生物分子，為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境。因此，反膠團萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質等生物分子的分離純化，特別是蛋白質類生物大分子。2023/10/834四種反膠團溶解蛋白質模型(a)為水殼模型，蛋白質位于水池的中心，周圍存在的水層將其與反膠團壁(表面活性劑)隔開；(b)蛋白質分子表面存在強烈疏水區(qū)域，該疏水區(qū)域直接與有機相接觸；(c)蛋白質吸附于反膠團內壁；(d)蛋白質的疏水區(qū)與幾個反膠團的表面活性劑疏水尾發(fā)生相互作用，被幾個小反膠團所“溶解”。2023/10/835表面性質不同的蛋白質可能以不同的形式溶解于反膠團相，但對于親水性蛋白質，目前普遍接受的是水殼模型。bcda反膠團的溶解作用2023/10/837反膠團有哪些有用的特征可用于生物物質的分離？將反膠團萃取技術與其他蛋白質分離技術相比較，指出它們各自的適用場合？影響反膠束萃取蛋白質的主要因素？

學習要求2023/10/838從毛發(fā)中提取胱氨酸

胱氨酸是白色六角形板狀晶體或結晶粉末，不溶于乙醇、乙醚，難溶于水。易溶于酸、堿溶液，但在熱堿溶液中可被分解。

胱氨酸比半胱氨酸穩(wěn)定，在體內轉變成半胱氨酸后參與蛋白質合成和各種代謝過程，有促進毛發(fā)生長和防止皮膚老化等作用。2023/10/839臨床上用于治療膀胱炎、各種禿發(fā)癥、肝炎、神經痛、中毒性病癥、放射損傷以及各種原因引起的巨細胞減少癥，并是治療一些藥物中毒等的特效藥。在食品工業(yè)、生化及營養(yǎng)學研究領域也有廣泛的應用。胱氨酸存在于人發(fā)、豬毛、羊毛、馬毛、羽毛及動物角等的蛋白質中，其中人發(fā)含量最高，達17.6％。胱氨酸是氨基酸中最難溶于水的一種，因此可利用這種特性，通過酸性水解，從廢雜豬毛、人發(fā)、雞毛、羊毛等角蛋白中，分離提取胱氨酸。常規(guī)提取工藝

上清液（回收氨基酸）

廢雜毛（豬毛、人發(fā)等）

清洗

干燥廢雜毛

水解水解液

中和胱氨酸粗品

提純沉淀物（粗品）

濾液（棄去）

結晶精制

干燥

精品2023/10/841操作步驟清洗：除去廢雜毛內混雜的泥沙、石塊、草木、鐵雜物等，用60°C左右的熱水，加少量洗滌劑，攪拌洗滌4～6分鐘，洗去吸附在雜毛上的油脂，然后撈出，再用清水沖洗干凈，濾干，放在通風處曬干或烘干備用。2023/10/842按廢雜毛的量，先量取2倍30％工業(yè)鹽酸，加入到玻璃鋼或搪瓷水解罐中，通蒸氣加熱到70～80℃，立即投入已清洗曬干的廢雜毛適量，繼續(xù)加熱，間隙攪拌，使溫度均勻。升溫到100°C時開始記溫，每隔半小時記溫1次，在1～1.5小時內升溫至110℃左右(即罐溫)，以后繼續(xù)維持罐壓14.7千帕(氣壓490千帕)，水解13個小時左右(用玻璃鋼盤管加熱，水解時間可縮短為6～7小時)，水解期間要有回流裝置，保證水解酸度，使水解更完全。水解時間可從水解罐內溶液溫度達100°C時計算起。水解：2023/10/843水解完全后，停止回流(回收的鹽酸可重用)，立即趁熱過濾。這時過濾很困難，應先用玻璃布抽濾除去大的黑腐質，然后再用雙層紗布抽濾，將濾液移到中和鍋或缸中，濾液用1:1的鹽酸沖洗2～3次，沖洗液一并倒入中和鍋或缸內，準備中和。2023/10/844將過濾好的濾液趁熱在攪拌下加入濃度30％～40％氫氧化鈉(工業(yè)燒堿)溶液，當中和到pH值達4.0時，停止加堿液，然后改用醋酸鈉飽和溶液中和到pH值為4.8左右，停止攪拌，靜置10～12小時，用滌綸布過濾沉淀物，甩干或吊干(抽濾液可供回收谷氨酸或制備化學醬油)，即得粗品。中和時溫度應保持在50℃左右，而且要在半小時內完成。中和：2023/10/845稱取適量的胱氨酸粗品，加入粗品量13％～14％的工業(yè)鹽酸(濃度為30％)，攪拌30分鐘左右，等粗品全部溶解后，再加入活性炭粉(按每100千克粗品加4～5千克活性炭粉投料)，加熱到90～98℃，在此溫度下恒溫攪拌2～3小時。然后過濾脫色液(回收活性炭粉，再生后可重用)，濾液加熱到80～85℃，在攪拌下加入濃度30％氫氧化鈉溶液，調節(jié)pH值至4.8時，停止加堿液，靜置，使結晶沉淀完全。虹吸上清液(可供回收胱氨酸和酪氨酸)，底部沉淀濾干后可離心甩干或直接用吊包吊干，即得灰白色的提純胱氨酸粗品。提純：2023/10/846稱取適量胱氨酸提純后的粗品，加入5倍量的1：12的鹽酸，加熱到40℃時，加入5％骨炭粉(按粗品量加)，升溫到60℃，保溫攪拌1小時。然后用布氏漏斗過濾，濾液再經3號重熔漏斗過濾，濾液應無色透明，如仍帶色，再進行脫色處理。將濾液移入搪瓷缸中，攪拌下加入10％氨水調節(jié)溶液pH值至4.8，靜置5～6天，即有胱氨酸精品析出，過濾出結晶，用無離子水洗至無氯離子，用吊布吊干后放入搪瓷盤中在烘箱內烘干(保持溫度在60℃左右)或真空干燥，即得產品。。精制、干燥

：2023/10/847產品規(guī)格和含量測定2023/10/848產品規(guī)格(1)外觀：產品為白色有光澤的六角形片狀結晶粉末，在水中微溶，不溶于酸和有機溶劑，能溶于無機酸中。(2)熔點：產品的熔點為258～261℃。2023/10/849產品規(guī)格(3)比旋光度：產品在25℃的比旋光度應為一195°C～一213°C。將樣品放在105℃恒溫烘箱中干燥2小時以上，然后精確稱樣2克，加1摩爾／升鹽酸，將其溶解成50毫升的溶液，按中國藥典附錄所載方法測定。比旋光度計算公式：

25180—a[a]D=+1.99×（25—t）L*d2023/10/8502023/10/851平面偏振光通過含有某些光學活性的化合物溶液時，能引起旋光現(xiàn)象，使偏振光的平面向左或向右旋轉。旋轉的度數(shù)，稱為旋光度。藥典系用鈉光譜的D線(589.3nm)測定旋光度，測定管長度為1dm，測定溫度為20℃。測定旋光度時，將測定管用供試液體或溶液（取固體供試品，按各藥品項下的方法制成）沖洗數(shù)次，緩緩注入供試液體或溶液適量置于旋光計內檢測讀數(shù)，即得供試液的旋光度。使偏振光向右旋轉者（順時針方向）為右旋，以“＋”符號表示；使偏振光向左旋轉者(反時針方向)為左旋，以“－”符號表示。2023/10/852產品規(guī)格(4)干燥失重：將樣品放入105℃恒溫箱中干燥至恒重，失重不得超過0.5％。(5)澄明度：精確稱取0.5克樣品，加1﹕3鹽酸溶液10毫升，振蕩溶解，溶液應無色透明或幾乎透明。

2023/10/8532023/10/854產品規(guī)格(6)氯化物測定：精確稱取0.25g樣品，加1mol／L硝酸10mL，使之溶解，再加水稀釋至50mL。用10mL移液管吸取10mL該溶液于一燒杯中，再加蒸餾水40mL，1mol/L硝酸1mL，1mol／L硝酸銀溶液1mL，搖勻。另外取氯化物標準液(1mL含0.01mg氯離子)7.5mL，按上法同樣處理，前者的渾濁度不應大于后者，即含氯量≤0.05％。2023/10/855產品規(guī)格(7)殘渣測定：分別精確稱取樣品4克、2克各置于恒重的白磁坩鍋或白金坩鍋中，在600～800℃高溫電爐中炭化，冷卻后即可測出殘渣重量(≤0.001)。2023/10/856產品規(guī)格(8)重金屬檢測：取上述4g樣品灼燒后的殘渣置于燒杯中，加12mL2mol／L鹽酸和0.5mL的1mol／L硝酸，在水浴上蒸干，再加11mol／L稀醋酸2mL、蒸餾水8mL，然后移入50mL納氏比色管中，加1mol／L硫化氫溶液10mL，加水至刻度，搖勻，在暗處放置10分鐘以上，與標準鉛溶液比較，鉛含量不應高于0.001。2023/10/857產品規(guī)格

(9)鐵鹽檢驗：取上述2克樣品灼燒遺留的殘渣于燒杯中，加2摩爾／升鹽酸12毫升、1摩爾／升硝酸0.5毫升，在水浴中蒸干，再加1﹕2鹽酸5毫升、蒸餾水10毫升，然后移入50毫升納氏比色管中，加10％硫氰酸銨溶液2毫升，如顯色，即與同樣處理后的6毫升標準液比較，不得更深(≤0.001)。2023/10/858產品規(guī)格(10)酪氨酸檢測：精確稱取干燥的樣品0.1克置于試管中，加1摩爾／升硫酸甲醛溶液1毫升，煮沸半分鐘，溶液應顯竹黃色(含量約為0.5％)，不得顯竹綠色

2023/10/859含量測定

準確稱取樣品大約0.3g置于100ml容量瓶中，加入10ml1％氫氧化鈉溶液，使之溶解，然后稀釋至刻度。用移液管取25ml稀釋液置于250ml碘量瓶中，再準確加入0.1摩爾／升溴液40ml及10ml0.1摩爾／L鹽酸，放置10分鐘以上，然后置于冰水浴中冷卻3分鐘左右，加1﹕2碘化鉀溶液5毫升，用0.1摩爾／升亞硫酸鈉滴定至淡黃色，加2毫升淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍色消失，然后作空白試驗校正。2023/10/860含量測定

(V2-V1)×C×0.02403含量=×100G式中：V1——空白試驗消耗亞硫酸鈉毫升數(shù)；

V2——樣品分析消耗亞硫酸鈉毫升數(shù)；．

C——亞硫酸鈉的摩爾濃度；

G——測定樣品的克數(shù)。按干燥好的樣品計算，合格產品中，L一胱氨酸的含量應在98．5％以上，出口產品在99％以上。

2023/10/861

TOMAC/正辛醇/異辛烷反膠團體系

萃取細胞色素C

TOMAC/正辛醇/異辛烷反膠團體系

萃取細胞色素C

2023/10/862研究了用三辛基甲基氯化銨(TOMAC)/正辛醇/異辛烷反膠團相轉移法萃取細胞色素C時,水相pH值、離子強度、正辛醇含量、相體積比、攪拌時間等因素的影響.結果表明,正辛醇的量