華清給水微生物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一普通光學(xué)顯微鏡的使用―、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馄胀ü鈱W(xué)顯微鏡的構(gòu)造和原理，掌握顯微鏡的使用和保養(yǎng)方法。學(xué)會(huì)使用顯微鏡進(jìn)行微生物形態(tài)的觀察，學(xué)會(huì)生物圖的繪制。學(xué)會(huì)用壓滴法制作玻片。二、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理裁物f說(shuō)糾裁物f說(shuō)糾rr'n1!虬:心嵌顯微鏡的種類很多，但基本構(gòu)造可分為機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分機(jī)械裝置由鏡座、鏡臂、鏡筒與物鏡轉(zhuǎn)移器、載物臺(tái)、移動(dòng)器粗細(xì)調(diào)節(jié)器組成。光學(xué)系統(tǒng)由目鏡、物鏡、聚光鏡、光圈組成。（1）目鏡：裝在鏡筒的上端，一般各有5x、10x、15x、16x等種不同的放大倍數(shù)的目鏡。目鏡只能把物鏡成的像再次放大，沒有辨析能力。（2）物鏡：顯微鏡的物鏡是由一組特殊的透鏡組成。一般有低倍鏡（4x、10x）、高倍鏡（40x）和油鏡（100x）。物鏡的性能由數(shù)值孔徑（NumericalAperture,N.A）決定，N.A=n.sina/2，其意為玻片和物鏡之間的折射率乘上光線投射到物鏡上的最大夾角的一半正弦。光線投射到物鏡的角度越大，顯微鏡的效能越大。光線通過幾種介質(zhì)的折射率（n）空氣1.0，水1.33，香柏油1.52，用油鏡時(shí)光線入射a/2為60°,sin60=0.87。以空氣為介質(zhì)時(shí)N.A=n.sina/2=1x0.87=0.87；以水為介質(zhì)時(shí)N.A=n.sina/2=1.33x0.87=0.87；以香柏油為介質(zhì)時(shí)N.A=n.sina/2=1.52x0.87=0.87。顯微鏡的性能還依賴物鏡的分辨率，分辨率即能分辨兩點(diǎn)之間的最小距離的能力。顯微鏡的總放大倍數(shù)為物鏡放大倍數(shù)和目鏡放大倍數(shù)的乘積。三、實(shí)驗(yàn)器材1?儀器用具顯微鏡、香柏油瓶（香柏油、二甲苯）、鏡頭紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、滴管實(shí)驗(yàn)材料安琪酵母菌懸液藥品試劑美蘭染液四、操作步驟觀察前的準(zhǔn)備（1）顯微鏡的安置（2）光源調(diào)節(jié)（3）調(diào)節(jié)雙筒顯微鏡的目鏡（4）聚光器數(shù)值孔徑值的調(diào)節(jié)顯微觀察（1）低倍鏡觀察標(biāo)本玻片必須先用低倍鏡觀察，因?yàn)榈捅剁R視野較大，容易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查位置。將待檢標(biāo)本玻片置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使觀察標(biāo)本處于物鏡正下方。轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，下降4x物鏡，使其接近標(biāo)本玻片，然后慢慢地提升鏡筒，直到視野內(nèi)出現(xiàn)物像后，改用細(xì)調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)到物像清楚為止，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位并記錄觀察結(jié)果。（2）高倍鏡觀察低倍鏡下找到目的物并將其移到視野中心，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置。微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物象清晰，利用推進(jìn)器移動(dòng)標(biāo)本仔細(xì)觀察并記錄觀察結(jié)果。（3）油鏡的觀察在高倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，將高倍鏡轉(zhuǎn)開，在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油。將油鏡轉(zhuǎn)入工作位置，調(diào)節(jié)微調(diào)節(jié)器，直至視野中出現(xiàn)物像并清晰準(zhǔn)焦為止，觀察標(biāo)本各部位并記錄觀察結(jié)果。油鏡的使用比較特殊，需要在載玻片與鏡頭之間滴加香柏油，這主要有以下原因：當(dāng)光線通過載波片時(shí)，由于玻璃與香柏油的折射率相近，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射，這樣就可以增加照明度和顯微鏡的分辨率，使鏡檢物清晰。顯微鏡用畢后的處理（1）上升鏡筒，取下載玻片。（2）用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。（3）用擦鏡紙清潔其他物鏡及目鏡。酵母菌形態(tài)觀察酵母菌是單細(xì)胞的真核微生物，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)有明且分化，個(gè)體比細(xì)菌大得多。酵母菌的形態(tài)通常有球狀、卵園狀、橢圓狀、柱狀或香腸狀等多種。酵母菌的無(wú)性繁殖有芽殖、裂殖和產(chǎn)生擲抱子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊抱子。酵母菌母細(xì)胞在一系列的芽殖后，如果長(zhǎng)大的子細(xì)胞與母細(xì)胞并不分離，就會(huì)形成藕節(jié)狀的假菌絲。美藍(lán)是一種弱氧化劑，氧化態(tài)呈藍(lán)色，還原態(tài)呈無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，活細(xì)胞由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能將美藍(lán)由籃色的氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色的還原態(tài)型，從而細(xì)胞呈無(wú)色;而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則由于細(xì)胞內(nèi)還原力較弱而不具備這種能力，從而細(xì)胞呈藍(lán)色，據(jù)此可對(duì)酵母菌的細(xì)胞死活進(jìn)行鑒別。（1）在載玻片中央加一滴呂氏堿性美蘭染液，取酵母菌懸液少許混合均勻。（2）蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及鑒別死、活細(xì)胞（酵母的活細(xì)胞為無(wú)色，死細(xì)胞或者代謝緩慢的老細(xì)胞呈藍(lán)色或者淡藍(lán)色）。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪出你在高倍鏡下觀察到的酵母菌形態(tài)。思考題（1）用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問題？在載玻片和鏡頭之間滴加的是什么油？起什么作用？（2）為什么在使用高倍鏡和油鏡時(shí)應(yīng)特別注意避免粗調(diào)節(jié)器的誤操作？（3）在酵母菌死活細(xì)胞的觀察中，使用美蘭液有何作用？實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的革蘭氏染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)菌的涂片及革蘭氏染色的基本方法和步驟。了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、實(shí)驗(yàn)原理簡(jiǎn)單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，簡(jiǎn)單染色不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩大類,是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。G—菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低,故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì),增加了細(xì)胞壁的通透性使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。三、實(shí)驗(yàn)器材菌種枯草芽抱桿菌12?20h牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)物；金黃色葡萄球菌24h牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)物；大腸桿菌24h牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)物。染色液和試劑結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅。器材或用具載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡、二甲苯、香柏油。四、操作步驟制片將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作涂片(注意涂片切不可過于濃厚)，干燥、固定。固定時(shí)通過火焰1—2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。染色(1)結(jié)晶紫色初染滴加適量(以蓋滿細(xì)菌涂面)的結(jié)晶紫染色液染色1?2分鐘，水洗。(2)碘液媒染滴加盧哥氏碘液，媒染1min，水洗。(3)乙醇脫色將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色15s至流出液無(wú)色，立即水洗。（革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。）（4）番紅復(fù)染滴加蕃紅復(fù)染2min，水洗。晾干鏡檢干燥后，從低倍鏡到高倍鏡觀察，最后用油鏡觀察。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別繪出你在油鏡下觀察到的3種細(xì)菌形態(tài)圖，并注明該菌的形態(tài)、顏色和革蘭氏染色的反應(yīng)。思考題（1）你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？（2）你的染色結(jié)果是否正確？請(qǐng)說(shuō)明原因。（3）乙醇脫色后復(fù)染前，革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌應(yīng)分別是什么顏色？（4）你認(rèn)為革蘭氏染色中，哪一個(gè)步驟可以省去而不影響最終結(jié)果？實(shí)驗(yàn)三濾膜法測(cè)定水中大腸菌群一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦脼V膜法測(cè)定水中大腸菌群。二、實(shí)驗(yàn)原理濾膜法是采用過濾器過濾水樣，使其中的細(xì)菌截留在濾膜上，然后將濾膜放在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，大腸菌群可直接在膜上生長(zhǎng)，從而可直接計(jì)數(shù)。所用濾膜是一種多孔硝化纖維膜或乙酸纖維膜，用水系過濾膜即可，其孔徑約0.45“m。三、實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)原料：伊紅美藍(lán)瓊脂平板或遠(yuǎn)藤氏瓊脂平板；自來(lái)水；器材或用具：鑷子；夾鉗；燒杯；真空泵；濾膜；過濾器等。四、操作步驟濾膜滅菌將濾膜放入裝有蒸餾水的燒杯中，加熱煮沸15min,共煮沸三次，前兩次煮沸后換水洗滌2?3次再煮，以洗去濾膜上殘留的溶劑。過濾器裝置用無(wú)菌手續(xù)將已滅菌的過濾器基座、濾膜、漏斗和抽濾瓶安裝好，其中濾膜用滅菌鑷子（浸在95%酒精內(nèi)，用時(shí)通過火焰滅菌）移至過濾器的基座上。其他可直接用手或夾鉗操作，但不要碰到伸入抽濾瓶的橡皮塞部分，以免染菌。將抽濾瓶接上真空泵。加水樣過濾直徑35mm的濾膜，所過濾的水量以培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落數(shù)不多于50個(gè)為適宜。一般清潔的深井水或經(jīng)處理過的河水與湖水等可取樣300?500mL；對(duì)比較清潔的河水或湖水，可取樣1?lOOmL；嚴(yán)重污染的水樣可先進(jìn)行稀釋；未知的水樣可做三個(gè)稀釋度，選擇菌落數(shù)合適的稀釋度進(jìn)行計(jì)算。本次實(shí)驗(yàn)用無(wú)菌鑷子將滅菌的濾膜移至過濾器中，加333mL自來(lái)水，抽濾。開動(dòng)真空泵進(jìn)行油濾。抽完后，加入等量的滅菌水繼續(xù)抽濾，目的是沖洗漏斗壁。濾畢，關(guān)上真空泵，用滅菌鑷子取濾膜邊緣，將沒有細(xì)菌的一面緊貼在遠(yuǎn)藤氏瓊脂平板或伊紅美藍(lán)瓊脂平板上。濾膜與培養(yǎng)基之間不得有氣泡。&將平板倒置于37°C下培養(yǎng)22—24h。挑取符合大腸菌群菌落特征的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。將鏡檢為革蘭氏陰性、無(wú)芽胞桿菌的菌落再接種一支乳糖蛋白胨