大鼠牙周炎模型的建立

大鼠牙周炎模型的建立

牙齦炎是牙齒缺損的主要原因，它嚴(yán)重威脅著人類的健康。關(guān)于牙周炎的有效治療方法，目前還不是一個難題。關(guān)于牙周炎模型的研究,國內(nèi)外均有報道,但都存在不同的缺陷。我們在挖掘祖國醫(yī)學(xué),應(yīng)用中藥治療牙周炎的研究中,通過局部鋼絲結(jié)扎結(jié)合全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素,成功地建立了牙周炎動物模型,現(xiàn)報告如下。1材料和方法1.1臨床中心提供選用160～200gWistar大鼠20只(蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心提供),雌雄各半,合格證號:醫(yī)動字14-006。采用隨機(jī)區(qū)組按性別各分為2組:對照組和實驗組。1.2注射部位及頻率對照組每只大鼠在全麻清醒后于后肢股二頭肌肌注生理鹽水(山東康寧藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號:05110103)1ml/kg,1次/2d共7次,然后1次/3d,共2次,共計9次;實驗組在全麻下用直徑0.2mm的正畸鋼絲結(jié)扎左上頜第二磨牙牙頸部,同時肌注醋酸潑尼松龍(浙江仙琚制藥股份有限公司,批號:060302)5mg/kg(1ml/kg),注射部位、頻率及次數(shù)同對照組。所有動物于實驗第6周和第8周分2批處死。1.3左下頜第二牙槽骨吸收①大體觀察:大鼠活動能力、被毛、食欲及糞便情況;②口腔肉眼觀察:牙齦及牙周袋情況;③X線檢查:觀察左上頜第二磨牙近遠(yuǎn)中牙槽骨吸收情況;④組織學(xué)觀察:將左上頜骨用40g/L多聚甲醛固定、100g/LEDTA脫鈣、石蠟包埋,頰腭向制作厚5μm的切片,HE染色。2結(jié)果2.1注射次數(shù)對大鼠一般情況的影響實驗組大鼠在注射激素第4天后出現(xiàn)拱背卷曲、少動倦怠、被毛疏松、無光澤、進(jìn)食下降、大便干燥等癥狀,隨著注射次數(shù)的增加,上述癥狀日益明顯,大鼠無一死亡;對照組大鼠表現(xiàn)正常(圖1)。2.2嘴唇型牙的產(chǎn)生實驗組大鼠在實驗后第4天,左上頜第二磨牙牙齦組織出現(xiàn)紅腫,1周后牙齦腫脹暗紅,觸及易出血,以后牙周袋形成、加深,齦組織糜爛溢膿。對照組口腔牙周組織無異常。2.3x線檢查實驗組左上頜第二磨牙近遠(yuǎn)中牙槽骨嵴吸收,根間暗影明顯,嚴(yán)重的吸收已達(dá)根中1/2;而對照組表現(xiàn)正常(圖2)。2.4牙槽骨的形態(tài)實驗組牙間乳頭溝內(nèi)上皮潰瘍、壞死,牙周袋形成,牙周膜炎癥明顯,牙周膜纖維排列紊亂,牙槽嵴吸收明顯,表面呈蠶食狀,牙槽骨呈骨質(zhì)疏松狀態(tài),可見明顯的破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩。對照組牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織無病理性改變,牙周膜纖維排列整齊,牙槽骨表面光滑,沒有破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩形成(圖3、4)。3討論3.1動物及模型的確定牙周病是口腔常見病,其復(fù)雜的致病因子、發(fā)病機(jī)制及某些防治措施等常無法直接在人體上進(jìn)行研究,因此動物實驗成為牙周病研究的基本實驗方法之一。易感牙周炎的動物種屬較多,一般可選用大鼠、金黃地鼠、犬、豬、猴等為造模動物。其中犬、猴的牙周解剖、組織結(jié)構(gòu)、微生物及免疫學(xué)等都與人類有極其相似之處,所以常作為牙周炎的研究模型。但由于這幾類動物價格昂貴,飼養(yǎng)及實驗條件要求高,所以難以具體實施研究。大鼠齒式為I1/1,M3/3,通常在出生后5周所有磨牙完全萌出,除切牙牙根持續(xù)生長外,其牙周組織如牙齦、牙槽骨、牙周膜的解剖結(jié)構(gòu)及相互關(guān)系與人相似;其口腔菌斑的形成及其生長發(fā)育、滋生、繁殖等亦都與人類相似,且由于大鼠價格便宜、操作簡便,所以在牙周炎的實驗研究中,大鼠是一種較好的模型動物。3.2牙周炎模型的制備方法人類牙周炎是以牙菌斑為始動因子的多因素疾病,菌斑誘發(fā)早期的炎癥過程,而口腔衛(wèi)生差、牙合創(chuàng)傷等局部因素及內(nèi)分泌障礙、免疫狀態(tài)、遺傳因素等全身因素影響著牙周炎的發(fā)生發(fā)展。菌斑和宿主的反應(yīng)共同作用導(dǎo)致了牙周炎的破壞過程。據(jù)報道實驗性牙周炎動物模型的建立有很多方法、有單純局部結(jié)扎法、接種致病菌法、飼以高糖黏性食料法、多種方法聯(lián)合應(yīng)用等。單純局部結(jié)扎法操作簡單,早期骨吸收明顯,但隨著時間延長,伴有骨的重新形成,骨喪失反而減少,此模型適用于短期研究。接種致病菌法、飼以高糖黏性食料法、多種方法聯(lián)合應(yīng)用同樣只強(qiáng)調(diào)了局部因素在造模中的作用,而忽視了全身因素,因此這些模型作為人類牙周炎的動物模型都不理想。但若只強(qiáng)調(diào)全身因素的作用,動物模型也不理想。羅云綱等在用Wistar大白鼠造模實驗中發(fā)現(xiàn)激素組牙齦乳頭炎癥較輕,牙周膜、牙槽骨未見明顯變化。因此,實驗性牙周炎模型必須具備上述2個因素,一是促使口腔局部菌斑堆積,二是降低宿主防御能力。目前有關(guān)牙周炎模型的報道較多,且基本上都強(qiáng)調(diào)了上述2方面的作用,但在具體造模的方法上均有一定的不足。史鳳芹等在造大鼠牙周炎模型時,醋酸潑尼松龍用法為肌注1.25mg/(只·d),共8d,存在著激素給藥量大,用藥連續(xù),大鼠死亡率高的缺點。周秀青等肌注醋酸潑尼松龍5mg/kg,每3d1次,共10次,大鼠無一死亡,但要耗時30d,時間較長。本實驗結(jié)合各方面的優(yōu)點,將造模方法加以改進(jìn),采用小劑量5mg/kg,將給藥間隔定為前7針為每2d1次,后2針為每3d1次,造模時間共需20d,發(fā)現(xiàn)激素對大鼠作用溫和,無一死亡。局部鋼絲結(jié)扎可造成菌斑、牙石堆積,因而通過局部與全身的共同作用造成大鼠牙周炎的形成。本實驗發(fā)現(xiàn),鋼絲結(jié)扎部位的牙齦乳頭出現(xiàn)潰瘍、壞死,慢性炎癥細(xì)胞浸潤,牙周袋形成,但與人類牙周炎相比,局部炎癥細(xì)胞浸潤較輕,說明除細(xì)菌刺激因素外,結(jié)扎的機(jī)械損傷也發(fā)揮了重要作用。糖皮質(zhì)激素可抑制蛋白質(zhì)的合成,尤其抑制膠原合成以及成骨細(xì)胞的形成及分化,使成熟的、具有分泌功能的成骨細(xì)胞及支撐破骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞數(shù)目減少。同時糖皮質(zhì)激素還影響成骨細(xì)胞的功能,使其不能正常地聚集于骨吸收部位來發(fā)揮骨形成作用,使骨形成遲緩。此外,還減少性激素的分泌,直接刺激破骨細(xì)胞,抑制腸道對鈣的吸收,增加腎對鈣、磷的排泄。我們在造模中觀察到雄鼠睪丸萎縮,重量下降,這樣性激素將分泌減少。同理,糖皮質(zhì)激素也用來誘發(fā)骨質(zhì)疏松動物模型。隨著中醫(yī)藥研究的深入,模擬中醫(yī)臨床的某些證候制造各種動物模型,已經(jīng)是研究工作中不可缺少的一個重要環(huán)節(jié)。臨床上牙周炎患者多為中老年人,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,相當(dāng)一部分牙周炎患者與腎陽虛有關(guān)。用一定量的外源性糖皮質(zhì)激素(醋酸強(qiáng)的松龍)使垂體前葉的ACTH釋放抑制,轉(zhuǎn)而使腎上腺皮質(zhì)分泌類固醇激素的釋放減少,動物出現(xiàn)一系列的“耗竭”現(xiàn)象,即拱背卷曲,肢尾冷,擠臥在一起,神淡,反應(yīng)遲鈍,自發(fā)活動時間減少,呼吸深遲,被毛疏松、失去光澤,消瘦,尿液白濁等病理狀態(tài)。本實驗中上述癥狀均出現(xiàn),按照中醫(yī)臟腑辨證標(biāo)準(zhǔn),外源性強(qiáng)的松龍