枸酸細菌內(nèi)毒素檢驗方法的建立

枸酸細菌內(nèi)毒素檢驗方法的建立

近年來，藥理學的應用越來越普遍。他們在藥物制備、藥物質(zhì)量穩(wěn)定、生物利用和主要藥物副作用等方面發(fā)揮了積極作用。目前有上千種輔料用于不同制劑中,但很大一部分藥用輔料的質(zhì)量標準仍未統(tǒng)一?！吨袊幍洹?010年版藥用輔料標準在前版基礎(chǔ)上進行了較大的增修,包括國內(nèi)已經(jīng)生產(chǎn)的常用品種和一些新型輔料,但仍有充實和完善的空間。藥典中規(guī)定,注射用藥用輔料的熱原或細菌內(nèi)毒素等應符合要求。但在其正文第二部分中所收載的藥用輔料均未收載細菌內(nèi)毒素或熱原檢查項。完善注射劑藥用輔料標準中的細菌內(nèi)毒素檢查項對臨床用藥安全具有重要意義。本文就注射劑常用pH值調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑枸櫞酸進行了細菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究,并建立其細菌內(nèi)毒素檢查法?？紤]到枸櫞酸的pH值偏酸,故將干擾試驗分成稀釋法及中和法兩部分來進行。1試劑tal枸櫞酸(哈藥集團三精明水藥業(yè)有限公司,批號1110006,1110007,1110008,1110009,1110010);細菌內(nèi)毒素工作標準品(WSE,中國藥品生物制品檢定所,批號150601-201072,規(guī)格120EU·Amp-1);鱟試劑(TAL,批號1106070,標示靈敏度0.25EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江安度斯生物有限公司;批號1012201,標示靈敏度0.03EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江安度斯生物有限公司;批號1012140,標示靈敏度0.25EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江博康海洋生物有限公司;批號1004200,標示靈敏度0.03EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江博康海洋生物有限公司);細菌內(nèi)毒素檢查用水(BET,批號1006180,規(guī)格50mL/瓶,湛江安度斯生物有限公司;批號1005040,規(guī)格50mL/瓶,湛江博康海洋生物有限公司)。2方法和結(jié)果2.1內(nèi)毒素檢查項《英國藥典》中,細菌內(nèi)毒素檢查項中規(guī)定其限值為“Lessthan0.5IU/mg,ifintendedforuseinthemanufactureofparenteraldosageformswithoutafurtherappropriateprocedurefortheremovalofbacterialendotoxins.”,《美國藥典》中,細菌內(nèi)毒素檢查項中規(guī)定“Thelevelofbacterialendotoxinsissuchthattherequirementintherelevantdosageform(s)inwhichAnhydrousAnhydrousCitricAcidisusedcanbemet.WherethelabelstatesthatAnhydrousAnhydrousCitricAcidmustbesubjectedtofurtherprocessingduringthepreparationofinjectabledosageforms,thelevelofbacterialendotoxinsissuchthattherequirementintherelevantdosageformmonograph(s)inwhichAnhydrousAnhydrousCitricAcidisusedcanbemet.”,《中國藥典》中,該品種未收載細菌內(nèi)毒素檢查項?？紤]到枸櫞酸作為注射劑輔料,不同制劑所用的量不同,我們參照《英國藥典》,將其細菌內(nèi)毒素限值確定為L=0.5EU·mg-1。2.2內(nèi)毒素靈敏度的測定根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值,用BET分別將WSE稀釋成2.0,1.0,0.5,0.25λ4個濃度的內(nèi)毒素標準溶液,每一濃度平行做4管,同時用BET做2支陰性對照管。按下列計算鱟試劑靈敏度的測試值(λc):λc=log-1(ΣX/4);X為反應終點內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值,試驗結(jié)果見表1～2。由表1～2可見不同靈敏度的兩批鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。2.3干預試驗采用稀釋法2.3.1dna的制備考慮到現(xiàn)市售鱟試劑分別為0.5,0.25,0.125,0.06,0.03EU·mL-1五個靈敏度。將批號為1110006的枸櫞酸用BET進行稀釋,使其終濃度分別為2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1,將濃度為1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1系列溶液記為NPC;同時在濃度為2,1,0.5,0.25,0.125mg·mL-1溶液中添加等體積4λ濃度的內(nèi)毒素溶液,使每一濃度試驗液中均含有2λ濃度的細菌內(nèi)毒素,將此系列溶液記為PPC。取標示靈敏度為0.25EU·mL-1不同廠家的TAL試劑,分別與上述NPC和PPC溶液進行反應,每一濃度重復做2管,結(jié)果見表3～4。由表3～4預試驗結(jié)果可初步判斷,0.125mg·mL-1及以下濃度的枸櫞酸對湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的TAL與內(nèi)毒素反應不存在干擾因素的影響;0.0625mg·mL-1及以下濃度的枸櫞酸對湛江博康海洋生物制品廠生產(chǎn)的TAL與內(nèi)毒素反應不存在干擾因素的影響。2.3.2wse的干擾考慮到上述干擾預試驗結(jié)果,使用靈敏度為0.03EU·mL-1的鱟試劑進行正式干擾試驗。將枸櫞酸用BET稀釋至終濃度為0.125mg·mL-1的溶液(供試品陰性對照液)。分別將WSE配成濃度為0.06,0.03,0.015,0.0075EU·mL-1的含供試品(濃度為0.125mg·mL-1)及不含供試品的內(nèi)毒素溶液,用湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)靈敏度為0.03EU·mL-1的TAL進行試驗。將枸櫞酸用BET稀釋至終濃度為0.0625mg·mL-1的溶液(供試品陰性對照液)。分別將WSE配成濃度為0.06,0.03,0.015,0.0075EU·mL-1的含供試品(濃度為0.0625mg·mL-1)及不含供試品的內(nèi)毒素溶液,用湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)靈敏度為0.03EU·mL-1的TAL進行試驗。同時設(shè)陰性對照(tc)。當tc為陰性時,結(jié)果按公式Es=lg-1(ΣXs/4)和Et=lg-1(ΣXt/4)計算,其中Xs和Xt分別為BET系列和枸櫞酸系列各反應終點細菌內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值。結(jié)果見表5～6。表5～6結(jié)果表明:Es在0.5λ～2λ之間,且Et在0.5Es～2Es范圍內(nèi)。說明0.125mg·mL-1濃度的枸櫞酸在此試驗條件下,對湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的0.06EU·mL-1或靈敏度更高的TAL與WSE反應無干擾;0.0625mg·mL-1濃度的枸櫞酸在此試驗條件下,對湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的0.03EU·mL-1或靈敏度更高的TAL與WSE反應無干擾。2.3.3供試品的制備取標示靈敏度為0.03EU·mL-1上述兩個廠家的TAL試劑進行檢驗,用BET將WSE稀釋成4λ,2λ(陽性對照溶液)濃度的溶液,再將四批枸櫞酸用BET進行稀釋,使其終濃度分別為0.12,0.06mg·mL-1的溶液,同時在濃度為0.12mg·mL-1的溶液中添加4λ的等體積標準內(nèi)毒素溶液作為供試品陽性對照溶液,并設(shè)陽性和陰性對照。結(jié)果見表7～8。表7～8結(jié)果表明,取標示靈敏度為0.03EU·mL-1上述兩個廠家的TAL試劑進行常規(guī)檢驗結(jié)果符合規(guī)定。2.4干擾試驗ph調(diào)整法2.4.1不同廠家tal試劑的抗菌材料檢測用1mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)樣品的pH值至6.0,后用BET進行稀釋,使其終濃度分別為2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1,將濃度為1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1系列溶液記為NPC;同時在濃度為2,1,0.5,0.25,0.125mg·mL-1溶液中添加等體積4λ濃度的內(nèi)毒素溶液,使每一濃度試驗液中均含有2λ濃度的細菌內(nèi)毒素,將此系列溶液記為PPC。取標示靈敏度為0.25EU·mL-1不同廠家的TAL試劑,分別與上述NPC和PPC溶液進行反應,每一濃度重復做2管,結(jié)果見表9～10。由表9～10預試驗結(jié)果可初步判斷:0.5mg·mL-1及以下濃度的枸櫞酸對上述兩個生產(chǎn)廠家的TAL與內(nèi)毒素反應不存在干擾因素的影響。2.4.2抗菌活性的測定將枸櫞酸用1mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)樣品的pH值至6.0,后用BET進行稀釋至終濃度為0.5mg·mL-1的溶液(供試品陰性對照液)。分別將WSE配成濃度為0.5,0.25,0.125,0.0625EU·mL-1的含供試品(濃度為0.5mg·mL-1)及不含供試品的內(nèi)毒素溶液,用上述兩個生產(chǎn)廠家的靈敏度為0.25EU·mL-1的TAL進行試驗。同時設(shè)陰性對照(tc)。當tc為陰性時,結(jié)果按公式Es=lg-1(ΣXs/4)和Et=lg-1(ΣXt/4)計算,其中Xs和Xt分別為BET系列和枸櫞酸系列各反應終點細菌內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值。結(jié)果見表11～12。表11～12結(jié)果表明:Es在0.5λ～2λ之間,且Et在0.5Es～2Es范圍內(nèi)。說明調(diào)節(jié)pH值后的0.5mg·mL-1濃度的枸櫞酸在此試驗條件下,對上述兩個生產(chǎn)廠家的0.25EU·mL-1或靈敏度更高的TAL與WSE反應無干擾。2.4.3tal試劑的常規(guī)檢驗將枸櫞酸用1mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)樣品的pH值至6.0,取標示靈敏度為0.25EU·mL-1的上述兩個廠家的TAL試劑進行常規(guī)檢驗。結(jié)果見表13～14。表13～14結(jié)果表明,取標示靈敏度為0.25EU·mL-1上述兩個廠家的TAL試劑進行常規(guī)檢驗結(jié)果符合規(guī)定。3工藝優(yōu)化方法枸櫞酸作為注射劑常用的pH值調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑,其熱原或細菌內(nèi)毒素應符合規(guī)定。細菌內(nèi)毒素檢查法操作比較簡單,準確度高,重現(xiàn)性