球毛殼dn35對(duì)植物生長(zhǎng)的影響及其生防效果

球毛殼dn35對(duì)植物生長(zhǎng)的影響及其生防效果

植物內(nèi)的細(xì)菌生活在植物體內(nèi)，不會(huì)引起明顯的革蘭氏感染。它們與植物是互惠共生的關(guān)系。已有研究表明,在沒(méi)有菌根真菌存在的環(huán)境中,內(nèi)生真菌可以起到替代菌根真菌的促生防病作用。真菌作為生防因子,國(guó)內(nèi)外研究較多的是木霉(Trichodermaspp.)、粘帚霉(Gliocladiumspp.)和盾殼霉(Coniothyriumminitans)。此外,常見(jiàn)真菌還有寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)、非致病性鐮刀菌(Fusariumspp.)、酵母(Candidaspp.)以及球毛殼(Chaeromiumglobosum)和螺卷毛殼(C.cochliodes)等。其作用機(jī)制,主要包括競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生和誘導(dǎo)抗病作用,以及對(duì)植物的促生作用。目前植物內(nèi)生真菌的研究和應(yīng)用主要集中于其次生代謝產(chǎn)物的抗癌作用、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主植物的競(jìng)爭(zhēng)力和抗逆性等方面。在畜牧業(yè)和草坪業(yè),禾本科植物羊茅屬內(nèi)生真菌可提高植物抗病性和抗蟲(chóng)性,增加產(chǎn)量。球毛殼(Chaetomiumglobosum)是子囊菌亞門核菌綱毛殼菌目毛殼菌科毛殼菌屬的真菌。在國(guó)外已被用于田間防治松苗猝倒病和蘋果黑星病。國(guó)內(nèi),原北京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究室曾從棉花植株內(nèi)分離出1種毛殼(Chaetomiumsp.),經(jīng)人工莖基部注射后,有抑制致萎鐮刀菌擴(kuò)展的作用。為了解植物內(nèi)生真菌球毛殼(Chaetomiumglobosum)ND35對(duì)植物生長(zhǎng)的影響及其生防活性,筆者分別在溫室和大田條件下檢測(cè)球毛殼ND35對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用和誘導(dǎo)抗病作用,以期為球毛殼ND35在田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株sordda、立枯絲核菌rhico辯證菌、番茄灰霉菌聚合物拮抗菌為植物內(nèi)生真菌球毛殼(Chaetomiumglobosum)ND35菌株。病原菌有楊樹(shù)腐爛病菌(Valsasordida)、立枯絲核菌(Rhizotoniasolani)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)。上述菌種由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系資源微生物實(shí)驗(yàn)室提供。植物材料:楊樹(shù)扦插枝條由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院提供,品種為107楊;供試菜豆品種為良選二號(hào)地豆王,由天津市薊農(nóng)種業(yè)公司生產(chǎn)。番茄品種為改良毛粉802,由西安秦皇種苗有限公司生產(chǎn)。1.2球毛殼nd33的麥粒培養(yǎng)基采集1年生楊樹(shù)枝條,剪成20cm左右的插穗。扦插楊樹(shù)枝條時(shí),設(shè)2個(gè)處理:①接種10g長(zhǎng)有球毛殼ND35的麥粒培養(yǎng)基;②接種10g無(wú)球毛殼ND35的麥粒培養(yǎng)基為對(duì)照。出芽后,4月26日開(kāi)始測(cè)量楊樹(shù)高度,連續(xù)7個(gè)月定期測(cè)量楊樹(shù)高度,直至12月,再測(cè)量楊樹(shù)1.3m處的胸徑,同時(shí)調(diào)查側(cè)根(d≥8mm)數(shù)量。1.3nd35毛殼誘導(dǎo)抗病性試驗(yàn)1.3.1發(fā)病情況調(diào)查10月中旬,在2個(gè)處理組的楊樹(shù)中分別隨機(jī)選擇9棵,設(shè)3次重復(fù)。在病原菌接種前3d,處理①的楊樹(shù)在根部再接種1次ND35,以提供刺激信號(hào);處理②的楊樹(shù)也刨根后重新種植,以提供可靠的對(duì)照試驗(yàn)。采用燙傷接種方法,在主干距地面高50和100cm(約樹(shù)干的1/3和2/3)處先用火燙傷樹(shù)皮,再接種含病原菌菌絲體的PDA菌餅。用脫脂棉、保鮮膜將接菌點(diǎn)包裹,每天滴加無(wú)菌水保濕,1周后去除脫脂棉、保鮮膜。在隨后1個(gè)多月統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況,以29d后發(fā)病的為0級(jí),26～28d發(fā)病的為1級(jí),23～25d發(fā)病的為2級(jí),20～22d發(fā)病的為3級(jí),19d之內(nèi)發(fā)病的為4級(jí)。分級(jí)計(jì)數(shù),計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和拮抗效果。拮抗效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100。1.3.2發(fā)病情況的確定由于環(huán)境和楊樹(shù)品種的因素,6月楊樹(shù)感染葉銹病。8月在楊樹(shù)1.3、1.7、2.1m處分別調(diào)查2個(gè)處理組楊樹(shù)葉片正面(冬孢子堆)及背面(夏孢子堆)的發(fā)病情況。在發(fā)病楊樹(shù)上,根據(jù)同一高度葉正面和葉背面的病斑面積占葉片總面積的比例確定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):沒(méi)有發(fā)病為0級(jí)、0～20%發(fā)病為1級(jí)、20%～40%發(fā)病為2級(jí)、40%～60%發(fā)病為3級(jí)、大于60%發(fā)病為4級(jí)。計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和拮抗效果。拮抗效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100。1.3.3灰霉菌生長(zhǎng)和懸浮液制備的測(cè)定取大小、飽滿度一致的菜豆、番茄種,在28℃下催芽2d后播種,用已滅菌的含30%育苗基質(zhì)的土壤種植于溫室中。將菜豆、番茄分別分為2個(gè)處理。處理①:接種拮抗菌ND35;處理②:不接種ND35。定期澆水。菜豆生長(zhǎng)8d后、番茄生長(zhǎng)6周后各取葉片15片,洗凈,自然晾干,在試驗(yàn)盆中保濕,備用。106cfu/ml的灰霉菌孢子懸浮液制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn),取10μl滴于葉片正面,于23℃保濕培養(yǎng)。36h后分別測(cè)量病斑長(zhǎng)短直徑,計(jì)算病斑面積,分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、病情指數(shù)和誘導(dǎo)抗性效果計(jì)算方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)。1.4接種立枯絲核菌取大小及飽滿度一致的菜豆種子,28℃催芽2d后播種于已滅菌的含30%育苗基質(zhì)的土壤中。處理組:播種時(shí)接種內(nèi)生菌球毛殼ND35,同時(shí)接種立枯絲核菌;對(duì)照組:播種時(shí)只接種立枯絲核菌。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),完全隨機(jī)排列。在接種10d后觀察發(fā)病情況,根據(jù)病斑直徑占莖基周長(zhǎng)的比例確定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):沒(méi)有發(fā)病的植株為0級(jí),<25%發(fā)病為1級(jí)、25%～50%發(fā)病為2級(jí)、50%～75%發(fā)病為3級(jí)、>75%發(fā)病為4級(jí)。計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。防治效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100。2結(jié)果與分析2.1在不同的植物中接種nd33在接種球毛殼ND35后,楊樹(shù)扦插苗在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)都未表現(xiàn)不良性狀。接種ND35后楊樹(shù)苗的平均高度高于對(duì)照組(圖1A),雖然統(tǒng)計(jì)分析不顯著,但也具有統(tǒng)計(jì)意義,這與印敬明等研究的ND35能顯著促進(jìn)番茄株高生長(zhǎng)的結(jié)果不一致。但是接種ND35后的楊樹(shù)苗1.3m處胸徑明顯大于對(duì)照,統(tǒng)計(jì)分析表明在0.05水平上差異顯著(圖1B);接種ND35的楊樹(shù)側(cè)根(d>8mm)數(shù)量要多于對(duì)照組(圖1C),且在0.05水平上差異顯著。寄主植物接種ND35后能為植物的生長(zhǎng)提供發(fā)達(dá)的根系,從而為植物的生長(zhǎng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。以上結(jié)果說(shuō)明ND35能夠?qū)闹髦参锏纳L(zhǎng)量產(chǎn)生有益影響,并能促進(jìn)楊樹(shù)根系、株高、胸徑的生長(zhǎng)。2.2nd35毛殼中的誘導(dǎo)抗病作用2.2.1分生孢子器分生孢子器通過(guò)對(duì)楊樹(shù)腐爛病發(fā)病情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn),處理①相對(duì)于處理②的楊樹(shù)病情較輕,在接種楊樹(shù)腐爛病菌后,處理②的楊樹(shù)首先出現(xiàn)腐爛病癥狀,呈現(xiàn)水漬病斑,略腫脹,皮層組織腐爛變軟,后期在病斑上長(zhǎng)出許多黑色小突起即病菌分生孢子器。以發(fā)病時(shí)間為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明,球毛殼ND35能誘導(dǎo)楊樹(shù)對(duì)腐爛病菌產(chǎn)生拮抗作用(表1)。2.2.2不同密度葉銹病葉片和葉片由于楊樹(shù)品種和氣候因素影響,楊樹(shù)感染葉銹病,其發(fā)病率達(dá)100%。通過(guò)發(fā)病葉片數(shù)占楊樹(shù)總?cè)~片數(shù)及發(fā)病面積占總面積的百分?jǐn)?shù)來(lái)看,處理①明顯比處理②葉銹病病情要輕,且楊樹(shù)越往上部病情越輕(表2)。葉片背面,在楊樹(shù)高1.7m處,拮抗效果最好;葉片正面,在楊樹(shù)高1.3m處拮抗效果最好。說(shuō)明球毛殼ND35對(duì)由楊樹(shù)柵銹菌(Melampsorapuplicola)引起的楊樹(shù)葉銹病有一定的拮抗效果。2.2.3用圖22分析試驗(yàn)結(jié)果表明,ND35對(duì)番茄、菜豆灰霉病均有誘導(dǎo)抗病作用(圖2)。比較試驗(yàn)組和對(duì)照組發(fā)病病斑面積發(fā)現(xiàn),接種ND35后,番茄和菜豆的病情指數(shù)分別為25.0和43.0,對(duì)灰霉病防治效果分別達(dá)58.85%和35.65%。2.3病情指數(shù)測(cè)定菜豆從感染立枯絲核菌到發(fā)病,需要一段較長(zhǎng)的時(shí)間。因此試驗(yàn)中選擇了接種病原菌后10d取樣調(diào)查病情指數(shù)。從試驗(yàn)結(jié)果(圖3)可以看出,菜豆幼苗不接種ND35的對(duì)照組和接種ND35的處理組病情指數(shù)分別為51.7和25.4,防治效果達(dá)50.9%,說(shuō)明球毛殼ND35對(duì)立枯絲核菌有較好的拮抗作用。3球毛殼nd33藥物代謝特性球毛殼ND35(過(guò)去報(bào)道為螺旋毛殼ND35)是從健康毛白楊中分離的1株植物內(nèi)生真菌,能夠較好定殖于番茄、黃瓜和菜豆植株內(nèi),并對(duì)番茄生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)作用,對(duì)黃瓜苗期猝倒病的防治效果達(dá)80.7%。這為利用植物內(nèi)生真菌防治植物病害奠定了基礎(chǔ)。該試驗(yàn)表明,球毛殼ND35在植物體內(nèi)定殖后能促進(jìn)楊樹(shù)根系和胸徑的生長(zhǎng),使植株粗壯,有利于提高植物的抗病性;接種球毛殼ND35能誘導(dǎo)楊樹(shù)對(duì)腐爛病菌和葉銹病菌產(chǎn)生較好的拮抗效果;也能誘導(dǎo)番茄和菜豆對(duì)灰霉病菌產(chǎn)生抗病性,誘導(dǎo)抗性效果分別達(dá)58.85%和35.65%。這可能是球毛殼ND35誘導(dǎo)植物產(chǎn)生了誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性(Inducedsystemicresistance,ISR)。這種誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性通常具有廣譜性、系統(tǒng)性和非特異性,使植物對(duì)多種真菌、細(xì)菌、病毒病害,甚至對(duì)一些害蟲(chóng)和線蟲(chóng)產(chǎn)生抗性,這為多途徑利用植物誘導(dǎo)抗病性防治植物病害開(kāi)辟了廣闊前景。毛殼菌為楊樹(shù)體內(nèi)習(xí)居的自然內(nèi)生菌優(yōu)勢(shì)種群,而非引進(jìn)的生防因素。在與寄主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中,在生理上已彼此適應(yīng)。因而具有較強(qiáng)的適生性,相對(duì)比較穩(wěn)定,易于在短期內(nèi)形成種群優(yōu)勢(shì),比引進(jìn)的外來(lái)拮抗菌具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力。這可能是球毛殼ND35能夠有效防治楊樹(shù)腐爛病和葉銹病的重要原因?？傊?內(nèi)生菌球毛殼ND35