五靈膠囊中柴胡皂苷d在小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

五靈膠囊中柴胡皂苷d在小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

五靈膠囊是由柴胡、五味子等中藥組成的復(fù)方制劑。具有平肝健脾、活血化瘀、治療乙型慢性肝炎的功效。柴胡在方中為主藥,柴胡皂苷d是柴胡中主要成分,具有抗炎、保肝、降低血中膽固醇等藥理作用。五靈膠囊中主要成分柴胡皂苷d在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征未見報(bào)道,本文對(duì)小鼠ig五靈膠囊后體內(nèi)柴胡皂苷d的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行試驗(yàn),為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1胡皂苷的提取純化五靈膠囊(Wuling)由西京醫(yī)院藥劑科中藥制劑室提供,批號(hào):20020925;五靈膠囊陰性樣品由本室模擬制備:柴胡皂苷d本室提取純化,白色粉末,熔點(diǎn)212～216°C,經(jīng)紫外、紅外光譜,EI-MS質(zhì)譜確證,純度97%。乙腈:色譜級(jí)Merck公司;水為三蒸水。日本島津SCL-6A高效液相色譜儀、C-R3A數(shù)據(jù)處理器,SPD-6A紫外檢測(cè)器,硫酸胺為分析醇,西安化學(xué)試劑廠;昆明小鼠,購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)證字SC×K(軍)2002-05。1.2試驗(yàn)品溶液的制備乙腈-水(40∶60)流速1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為204nm,柱溫:室溫。取五靈膠囊和五靈膠囊陰性樣品分別ig小鼠5.5g·kg-1,1.5h采血,分取血漿同樣品制備方法制備供試品液,再取正常小鼠血漿+柴胡對(duì)照品同法制備供試品液。取各樣品供試液20μl分別進(jìn)樣測(cè)定分析柴胡皂苷d的HPLC色譜圖。1.3靈膠囊給藥、血樣的制備昆明小鼠228只,♂,置相對(duì)濕度45%～75%、溫度23～25°C動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3日,禁食過夜,隨意飲水,按體重分層隨機(jī)分組,每采血時(shí)間點(diǎn)為一組,每組4只,五靈膠囊按5.5g·kg-1ig給藥(相當(dāng)于人體給藥劑量10倍,每克藥粉含柴胡皂苷d4.1mg),分別于給藥后0.16,0.32,0.5,1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,10.0,12.0,14.0,18.0,20.0,24.0h眼眶采血,置于肝素化的離心管內(nèi),室溫放置30min,3000r·min-1離心20min,分離血漿,每組血漿合并,置-20°C凍存,待測(cè)。藥物重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。1.4單次給藥后小鼠血漿中2.受試小鼠204只,♂,試驗(yàn)條件同上,按體重分層隨機(jī)分為大、中、小3個(gè)劑量組,每個(gè)劑量組68只小鼠,三劑量組分別按體重灌胃給予五靈膠囊(大劑量16.6g/kg、中劑量11.1g/kg、小劑量5.5g/kg),分別于給藥后0.16,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,10.0,14.0,18.0,20.0h眼眶采血,每個(gè)劑量組每個(gè)采血點(diǎn)4只小鼠,置于肝素化的離心管內(nèi),室溫放置30min,3000r·min-1離心10min,分離血漿,合并4只小鼠血漿,置-20°C凍存,待測(cè)。觀察五靈膠囊3劑量組的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)是否一致。1.5樣品溶液的制備依時(shí)間點(diǎn)取4只小鼠混勻血漿0.7mL,加0.25g硫酸胺,旋渦混勻1min,再加乙腈-甲醇(4∶1)溶液4mL,混懸3min,3000r·min-1離心20min,取上清液置小蒸發(fā)皿內(nèi),于40°C水浴上用氮?dú)獯蹈?殘?jiān)由V甲醇溶解至1mL,搖勻,作為樣品供試品液,-20°C放置過夜。次日用0.22μm微孔濾膜抽濾,HPLC進(jìn)樣20μL,測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算含量。1.6小鼠血漿中樣品液的制備取小鼠20只,隨機(jī)分成5組,每組4只,禁食給水,次日灌胃給藥后1h,小鼠按組眼眶采血,離心分離血漿,每組小鼠血漿合并,混勻,每組分取0.7mL血漿,按血漿樣品制備方法制備樣品液,多人同法操作共制得5份樣品液,HPLC法測(cè)得5份樣品含量。再取對(duì)照樣品和供試樣品液按樣品測(cè)定方法測(cè)定峰面積并計(jì)算含量,照樣品和供試樣品液放置4°C冰箱內(nèi),日內(nèi)每3h測(cè)定1次,共測(cè)5次,日間每日測(cè)1次,共測(cè)5次。2結(jié)果2.1小鼠血漿中柴胡皂苷d的分離在此條件下,五靈膠囊吸收入血的其它成分或代謝產(chǎn)物均可達(dá)到基線分離,小鼠血漿中柴胡皂苷d可得到良好的分離,峰形基本對(duì)稱,滯留時(shí)間適宜為11.21min。五靈膠囊陰性樣品血清和空白血清對(duì)測(cè)定無干擾,結(jié)果見圖1。2.2血藥濃度測(cè)定取空白血漿0.7mL,一式7份,加入柴胡皂苷d對(duì)照品溶液,使血漿終濃度分別為6.25,12.5,25,100,200,400,800μg·mL-1,按血漿樣品的處理方法操作制備樣品并測(cè)定峰面積值,以峰面積值對(duì)血藥濃度作圖,得回歸方程Y=-6370+1364Cr=0.9999。線性范圍6.25～800μg,最低檢測(cè)限5μg·mL-1。2.3樣品制備和回收率取給藥后的混合血漿0.7mL,一式2份,一份加已知量的柴胡皂苷d,另一份不加,按血漿樣品處理方法操作制備樣品,同法連續(xù)制備7次回收樣品,測(cè)定二者峰面積值并計(jì)算含量,兩者含量之差除以加入柴胡皂苷d的量,得血漿樣品百分回收率,結(jié)果表明7次回收試驗(yàn)的平均回收率為96.88%,RSD=2%。2.4儀器測(cè)定的穩(wěn)定性柴胡皂苷d對(duì)照品的日內(nèi)差異測(cè)定值分別為88540、88899、88459、88563、88748平均值為88641.8±178.47,RSD=0.20%。柴胡皂苷d對(duì)照品的日間差異測(cè)定值分別為93467、93773,93406、93926、93782,平均值為93670.8±223.38,RSD=0.23%。測(cè)得五靈膠囊樣品的日內(nèi)差異含量分別為91.62,91.10,92.11,92.16,91.37μg·mL-1,平均含量為91.67±0.461,RSD=0.50%;測(cè)得五靈膠囊樣品的日間差異含量分別為88.76、88.70、88.79、89.55、89.96μg·ml-1,平均含量為89.15±0.57011,RSD=0.63%,儀器測(cè)定的穩(wěn)定性符合測(cè)定要求,對(duì)照品液和供試品液在測(cè)試期間是穩(wěn)定的,可滿足測(cè)定要求。2人重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得5組樣品含量分別為86.14,85.81,87.61,87.54,88.69μg·ml-1,平均含量為87.158±1.177,RSD=1.35%,同樣品多次操作測(cè)定含量波動(dòng)不大,說明此測(cè)定方法穩(wěn)定。2.5藥動(dòng)學(xué)參數(shù)判斷依五靈膠囊給藥劑量每克藥粉含柴胡皂苷d的濃度,五靈膠囊3劑量組測(cè)得血藥濃度數(shù)據(jù)用SIP藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行計(jì)算,其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Ke、Ka、T1/2Ke、T1/2Ka、Tmax等不相一致,符合非線形動(dòng)力學(xué)特征。3劑量血藥濃度——時(shí)間曲線基本相似,見圖2。計(jì)算所得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。3不同劑量五靈膠囊對(duì)體內(nèi)柴胡皂苷d的藥動(dòng)學(xué)從小鼠血漿樣品內(nèi)提取柴胡皂苷d,HPLC法能較好地測(cè)定小鼠血漿中柴胡皂苷d含量,回收率與重復(fù)性試驗(yàn)證明此方法可行,分離度和穩(wěn)定性較好,五靈膠囊陰性樣品分析表明血漿中其它成分對(duì)柴胡皂苷d測(cè)定無干擾。中藥方劑吸收入血成分復(fù)雜,色譜峰較多內(nèi)標(biāo)無合適的滯留時(shí)間,故采用外標(biāo)法,同次試驗(yàn)均用血漿對(duì)照品與樣品同時(shí)測(cè)定并計(jì)算含量,可消除因操作誤差所致含量計(jì)算差異。五靈膠囊3劑量組的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)并不一致,為非線形動(dòng)力學(xué)特證,依據(jù)AIC擬合度和擬合優(yōu)度值數(shù)據(jù)判斷,五靈膠囊所含柴胡皂苷d在小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程符合一級(jí)吸收單室模型。就峰形而言,五靈膠囊中柴胡皂苷d的藥時(shí)曲線為雙峰,其達(dá)峰時(shí)和峰濃度各有2個(gè),達(dá)峰時(shí)分別為1.45h,6.48h,峰濃度分別為83.81μg·ml-1和119.63μg·ml-1,產(chǎn)生雙峰可能與肝腸循環(huán)有關(guān),按常理肝腸循環(huán)的后峰應(yīng)低于前峰,可本試驗(yàn)結(jié)果兩峰大致相似,AUC也相等,這后峰為何相似于前峰?柴胡