柑橘綠霉病菌拮抗酵母菌的篩選及防治效果

柑橘綠霉病菌拮抗酵母菌的篩選及防治效果

柑橘霉菌是柑橘貯藏過程中的主要疾病。目前,柑橘采后病害的防治主要依賴于化學(xué)殺菌劑,如抑霉唑、噻苯咪唑、二甲嘧菌胺、咯菌腈等,但長期使用化學(xué)殺菌劑易造成環(huán)境和食品污染,同時也易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性。隨著人們對果品質(zhì)量要求的不斷提高和環(huán)保意識的增強,很有必要開辟能夠代替化學(xué)藥劑的安全、無毒且有效的生物試劑,微生物生防劑即是其中的一種。用于采后生物防治的拮抗微生物包括細菌、放線菌以及酵母菌,其中酵母菌以其拮抗效果好、不產(chǎn)生毒素、可以和化學(xué)殺菌劑混用等優(yōu)點成為采后病害生物防治研究的熱點。近年來,國內(nèi)外學(xué)者就拮抗酵母菌用于果蔬采后病害防治進行了廣泛研究。Zahavi等用假絲酵母(Cryptococcuoleophila)防治由灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)及黑曲霉(Aspergillusniger)引起的腐爛病,取得了良好的防治效果;Janisiewicz等用羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)處理蘋果果實,可有效地預(yù)防青霉病的發(fā)生;梁學(xué)亮等研究了假絲酵母(CandidaSp.)CWW-4對柑橘采后綠霉病的防治效果;陳麗鋒等篩選到1株拮抗酵母菌,經(jīng)鑒定為歐諾比假絲酵母,并首次將該酵母菌應(yīng)用于果蔬的保鮮。目前,拮抗酵母菌假絲酵母(Candidaoleophila)、白色隱球酵母(C.albidus)在美國和南非已實現(xiàn)了商品化,并已廣泛用于果蔬采后的病害防治。本研究通過離體及果實接種試驗,對能有效防治柑橘綠霉病的拮抗酵母菌進行了篩選和鑒定,并對其抑菌效果進行了研究,以期為柑橘綠霉病的生物防治及綜合防治技術(shù)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1主要材料1.1.1全粒砂糖柑的消毒選擇外觀整齊、大小一致、無病蟲害、無機械損傷且未經(jīng)過采后處理的砂糖柑果實,運到實驗室后立即用質(zhì)量分數(shù)2%的次氯酸鈉溶液消毒5min,自來水沖洗,晾干后待用。1.1.2馬鈴薯葡萄糖運行液的配制柑橘綠霉病菌(P.digitatum)分離于自然發(fā)病的柑橘果實,在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)7～14d,用含有質(zhì)量分數(shù)0.05%Tween80的無菌水配成孢子懸浮液后,用血球計數(shù)板配制成濃度為106mL-1的孢子懸液。1.2菌種的培養(yǎng)、篩選參考Wilson等的方法,并作一定調(diào)整。從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝果園采集木瓜、梨、柑橘果實樣品,采集后立即用刀片切成2cm×2cm的小塊,每份樣品稱取10g,加入到裝有90mL豆芽汁葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶中,然后加入幾滴質(zhì)量分數(shù)0.1%的硫酸鏈霉素,置于恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)(26℃、120r/min)48h。用移液槍移取1mL菌液,用濃度梯度法稀釋后,分別取稀釋10-3,10-4,10-5倍的菌液100μL,涂布于豆芽汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,然后挑取培養(yǎng)特征相異的單菌落,經(jīng)反復(fù)純化培養(yǎng)后編號,保存?zhèn)溆谩＞旰Y選采用酵母菌與柑橘綠霉病菌混菌試驗,用無菌水制備108,107,106,105CFU/mL的酵母菌懸浮液,將柑橘綠霉病菌制成106,105,104mL-1的孢子懸浮液,分別各吸取1mL移入20mL50℃左右的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基中,混勻后倒入無菌平皿中置水平位置冷卻。于28℃培養(yǎng)2～10d,每處理3個重復(fù),試驗重復(fù)2次,分別于培養(yǎng)的第2,6,10天觀察并記錄菌落生長情況,篩選對柑橘綠霉病菌具有較強拮抗作用的拮抗酵母菌株。1.3有關(guān)tea胚胎血漿培養(yǎng)的確定1.3.1生理生化特征參照文獻的方法,鑒定菌株HP-10的生理生化特征。1.3.2植物基因組dna提取采用酵母菌18SrDNA的通用引物EF3(5′-TCCTAAATGACCAAGTTTG-3′)和EF4(5′-GGAAGGGRTGTAT-TTATTAG-3′)進行PCR擴增。酵母菌總DNA的提取,參照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒進行。反應(yīng)體系(50μL)為:模板DNA1μL,引物EF3(10μL/L)和EF4(10μL/L)各1.5μL,2×PCRMasterMix20μL,雙蒸水26μL。PCR程序如下:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,48℃退火1min,72℃延伸2min,共循環(huán)35次;最后72℃延伸10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物純化后測序,測序由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司完成。在GenBank數(shù)據(jù)庫,中利用Blast對所測定的18SrDNA序列與已報道的酵母菌菌株的18SrDNA全序列進行同源性比較,然后應(yīng)用MEGA3.1和DNAMAN軟件進行同源性比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。1.4抗感染藥物hp-10對柑橘綠霉病的預(yù)防作用1.4.1培養(yǎng)柑橘綠霉病原菌采后生防菌子萌發(fā)參照Janisiewicz等的方法,分別吸取濃度為106,107,108CFU/mL的酵母菌懸浮液100μL,放入盛有5mLPDB培養(yǎng)基的試管中,以100μL滅菌蒸餾水為對照;再在各試管中加入100μL濃度為108mL-1的柑橘綠霉病菌孢子懸浮液,置于恒溫搖床上在25℃下80r/min振蕩培養(yǎng)24h,顯微鏡下鏡檢孢子的萌發(fā)情況,用無菌水梯度稀釋孢子濃度至每視野為100～120個,以孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管長度超過孢子平均寬度時視為萌發(fā),按此標準統(tǒng)計各處理孢子萌發(fā)情況,計算孢子萌發(fā)率。每處理重復(fù)3次,取平均值。1.4.2田間發(fā)病測定參照Janisiewicz等的方法,用消毒的接種針在柑橘的赤道部位刺1個4mm(深)×3mm(寬)的傷口,于傷口晾干后分別接種30μL106,107,108CFU/mL的拮抗酵母菌懸浮液,以無菌水為對照,3h后再接種20μL106mL-1的柑橘綠霉病菌孢子懸浮液。果實晾干后于25℃貯藏,并保持95%左右的濕度,分別于2,4,6d后測定發(fā)病率和病斑直徑。每處理8個果實,試驗重復(fù)3次。1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用SAS軟件(Version8.01,SASInstituteInc.,Cary,NC)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,試驗結(jié)果用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法(Duncan’smuitiplerangetest,DMRT)進行差異顯著性分析(P<0.05)。2結(jié)果與分析2.1酵母菌的篩選從果實樣品分離獲得具有酵母菌性狀的菌株13株,通過混菌試驗篩選出了對柑橘綠霉病菌有較好抑菌效果的酵母菌株HP-10(表1)。108CFU/mLHP-10菌株懸浮液與不同濃度柑橘綠霉病菌混合培養(yǎng)10d以上,均未見病原菌菌落生長,因此用菌株HP-10進行后續(xù)研究。2.2橘子樹霉菌與酵母菌hp-10的測定2.2.1菌體細胞形態(tài)觀察酵母菌HP-10在PDA平板上形成的菌落呈圓形,乳白色,表面隆起,邊緣整齊,直徑3～4mm,表面無光澤,質(zhì)地黏稠,有芳香型氣味。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,菌體單細胞呈卵圓形或橢圓形。其生理生化特征見表2。2.2.2長度約為84%bp以EF3和EF4為引物,通過酵母菌特異性PCR反應(yīng)擴增18SrDNA序列,所得DNA片段為單一條帶,長度約為1496bp(圖1)。將該序列與GenBank中的相應(yīng)序列進行比對,結(jié)果(圖2)顯示,HP-10菌株與馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)W103的同源性為100%,結(jié)合2.2.1結(jié)果,初步確定HP-10菌株為馬克斯克魯維酵母,其GenBank登錄號為HQ414234。2.3抗感染藥物hp-10對柑橘綠霉病的預(yù)防作用2.3.1兩組菌懸浮液對柑橘綠霉病菌芽孢萌發(fā)的影響PDB試驗結(jié)果表明(圖3),不同濃度拮抗菌懸浮液均可抑制柑橘綠霉病菌孢子的萌發(fā)。酵母菌濃度越大其抑制效果越明顯,且各處理組的孢子萌發(fā)率均顯著低于對照(P<0.05)。2.3.2其它濃度hp-10懸浮液的抑制效果試驗結(jié)果(圖4,圖5)表明,拮抗酵母菌HP-10懸浮液的濃度越高,其對綠霉病原菌(P.digitatum)引起的柑橘果實綠霉病發(fā)病率和病斑大小的抑制效果越好。HP-10處理果實貯藏2d后,以108CFU/mLHP-10懸浮液的抑制效果最好,發(fā)病率僅為6.67%,平均病斑直徑為2.14mm,與其他濃度酵母菌懸浮液的處理效果存在顯著差異;107和106CFU/mL酵母菌HP-10懸浮液的處理效果也明顯優(yōu)于對照,貯藏4d以后,107和106CFU/mLHP-10懸浮液處理果實的發(fā)病率與對照相比無顯著差異,但果實的病斑直徑仍顯著低于對照;108CFU/mLHP-10懸浮液處理的果實,在處理第4和6天的發(fā)病率分別為37.71%和82.22%,病斑直徑分別為16.32和38.61mm,而對照的發(fā)病率均為100%,病斑直徑為85.06和86.37mm,二者存在顯著差異。3酵母菌hp-10的抗菌作用酵母菌作為生防因子用于果蔬采后的防腐保鮮,一般具有遺傳穩(wěn)定、抑菌譜廣、抗逆性強、可以與化學(xué)殺菌劑混用等特點,而且其作為一種有益微生物已在食品加工、飲料發(fā)酵等產(chǎn)業(yè)得到廣泛應(yīng)用,不會產(chǎn)生危害人和寄主的代謝產(chǎn)物,其安全性已經(jīng)得到了廣泛證實。本研究從木瓜、梨、柑橘表面分離篩選到13株酵母菌,經(jīng)過混菌試驗篩選得到拮抗酵母菌HP-10,并通過生理生化特征結(jié)合18SrDNA序列分析,將其鑒定為馬克斯克魯維酵母(K.marxianus),該菌株對柑橘綠霉病菌表現(xiàn)出了良好的離體和活體抑制效果。目前,馬克斯克魯維酵母菌主要用于發(fā)酵飲料、發(fā)酵產(chǎn)乙醇等方面,具有很高的安全性,但尚未見其用于果蔬采后病害防治的相關(guān)報道。本研究篩選的酵母菌HP-10的拮抗效果與濃度呈正相關(guān),當HP-10懸浮液濃度為108CFU/mL時,用其接種柑橘綠霉2d后,柑橘綠霉病菌的發(fā)病率僅為6.67%,平均病斑直徑僅為2.14mm,均顯著低于對照;處理6d以后,108CFU/mLHP-10懸浮液處理果實的發(fā)病率雖有所升高,但病斑直徑仍然較小,為38.61mm,也顯著低于對照。以上試驗結(jié)果表明,拮抗酵母菌HP-10主要通過抑菌作用延緩柑橘綠霉病的發(fā)生,而不會直接殺死病原菌,這與Hashem等、Ge等的研究結(jié)果一致。菌株HP-10在較高濃度時對柑橘綠霉病害的防治效果才能達到最佳,這與F