制藥工業(yè)廢水中14種沙星類抗生素的液相色譜分析法

制藥工業(yè)廢水中14種沙星類抗生素的液相色譜分析法王雪平;朱惠斌【摘要】采用Na2EDTA螯合制藥工業(yè)廢水中的金屬離子，通過HLB固相萃取柱的富集、凈化，經(jīng)C18色譜柱分離，熒光檢測器測定，建立了高效液相色譜法同時(shí)測定制藥工業(yè)廢水中14種沙星類抗生素殘留量的方法結(jié)果表明在0.5~100.0mg/L范圍內(nèi),14種沙星類抗生素濃度與其色譜峰峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.999;方法檢出限為0.005-0.070mg/L,測定下限為0.02-0.28mg/L;加標(biāo)平均回收率為90.7%-98.1%,RSD為1.1%-3.2%.【期刊名稱】《工業(yè)水處理》【年(卷)，期】2019(039)007【總頁數(shù)】5頁(P89-93)【關(guān)鍵詞】沙星類抗生素;制藥工業(yè)廢水;高效液相色譜【作者】王雪平;朱惠斌【作者單位】黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475004潢河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開封475004【正文語種】中文【中圖分類】O657.7+2沙星類抗生素也稱為喹諾酮類抗生素，因具有強(qiáng)大的廣譜殺菌作用在臨床上被廣泛應(yīng)用〔1-4〕。但抗生素制藥工業(yè)也產(chǎn)生了很多污染物，尤其是化學(xué)制藥工業(yè)廢水，據(jù)統(tǒng)計(jì)其污水排放量占全國污水排放量的2%〔5-6〕，而現(xiàn)有廢水處理工藝無法將化學(xué)制藥工業(yè)廢水中存在的沙星類抗生素殘留完全去除。沙星類抗生素隨著廢水排放進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后，可誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性，可在農(nóng)副產(chǎn)品中殘留，可通過食物鏈對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅〔7-8〕。因此，需加強(qiáng)對(duì)制藥工業(yè)廢水中抗生素殘留種類及其殘留量的監(jiān)督檢測。目前關(guān)于沙星類抗生素的檢測方法主要有毛細(xì)管電泳法〔9〕、免疫法〔10〕、液相色譜法（HPLC）〔11-15〕、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）〔16-19〕等，其中LC-MS/MS法因檢測靈敏度好、低檢出限而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)境等領(lǐng)域，但由于LC-MS/MS儀器昂貴、分析成本高，且操作復(fù)雜，不適合中小企業(yè)和基層環(huán)保部門對(duì)制藥工業(yè)廢水中沙星類抗生素的日常檢測需求。筆者采用螯合劑和萃取柱對(duì)制藥工業(yè)廢水進(jìn)行前處理，結(jié)合高效液相色譜法測定制藥工業(yè)廢水中14種沙星類抗生素，研究了螯合劑種類、萃取柱種類、流動(dòng)相條件等因素對(duì)萃取效率的影響，并應(yīng)用于制藥工業(yè)廢水中14種沙星類抗生素殘留量的檢測。1實(shí)驗(yàn)部分1.1主要儀器與試劑Agilent1200型高效液相色譜儀，配有熒光檢測器FLD，美國Agilent公司；AC210S型電子天平，德國薩多利斯公司；Vortex-Genie2渦旋混合儀，美國ScientificIndustries公司；5430R型高速離心機(jī)，德國艾本得公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；AutotraceSPE全自動(dòng)固相萃取儀，美國Caliper公司；pHSJ.5型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；MG-2200型氮吹儀，日本EYELA公司。14種沙星類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、丹諾沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、司帕沙星、二氟沙星、加替沙星、奧比沙星，美國Dr.EhrenstorferGH公司，純度均295.0%。甲醇、甲酸、乙腈、三乙胺，均為色譜純，德國Merk公司；Na2EDTA、鹽酸、磷酸均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。14種沙星類抗生素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量的16種沙星類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用適量體積比85:15的甲醇和乙腈混合溶液溶解并定容，配制成0.1g/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。1.2液相色譜條件色譜柱：HydrosphereC18（250mmx4.6mmx5pm）;流速1.0mL/min;柱溫30OC;進(jìn)樣量10pL;熒光檢測器檢測波長（激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長450nm）;流動(dòng)相A是體積比為85:15的甲醇和乙腈混合溶液，流動(dòng)相B是0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（用1.0mol/L三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.5），梯度洗脫，即10%A洗20min，然后10%~35%A洗15min,50%A洗10min，最后10%A洗10min。1.3樣品前處理以0.45pm微孔濾膜過濾除去制藥工業(yè)廢水中的懸浮物后，準(zhǔn)確量取制藥工業(yè)廢水100mL,加入1g金屬沉淀劑Na2EDTA，搖勻后靜置5min,8000r/min離心5min,用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)上清液pH至4.0，通過HLB固相萃取柱富集、凈化。上清液過HLB柱前，HLB柱依次用3mL丙酮、3mL甲醇和3mL水活化；過HLB柱時(shí)，流速控制在1mL/min以內(nèi)；過HLB柱后，用6mL水淋洗，負(fù)壓抽干，用6mL含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45C水浴中氮吹至近干，用流動(dòng)相B溶解并定容至1mL,用0.22pm有機(jī)濾膜過濾，濾液供HPLC分析。2結(jié)果與討論2.1檢測波長的選擇利用熒光檢測器（FLD）對(duì)沙星類抗生素在200~800nm范圍內(nèi)進(jìn)行多激發(fā)和多發(fā)射掃描試驗(yàn)，以確定最佳的激發(fā)波長和發(fā)射波長，結(jié)果見表1。表1沙星類抗生素化合物信息序號(hào)化合物保留時(shí)間/min激發(fā)波長/nm發(fā)射波長/nm1依諾沙星（ENO）12.362804512氧氟沙星（OFL）14.322824583培氟沙星（PEF）18.342794484諾氟沙星（NOR）20.212804505環(huán)丙沙星（CIP）22.452814556洛美沙星（LOM）24.232804507丹諾沙星（DAN）30.372804508恩諾沙星（ENR）34.282614309奧比沙星（ORB）41.7626639210沙拉沙星（SAR）42.4829850011二氟沙星（DFX）45.1229454912司帕沙星（SPA）48.2735562013加替沙星（GTF）51.2335552014達(dá)氟沙星（DNF）52.75280450如表1所示，14種沙星類抗生素均具有熒光響應(yīng)，最大激發(fā)波長為261~355nm,最大發(fā)射波長為390-620nm。大部分沙星類的激發(fā)波長和發(fā)射波長最大吸收波長較為接近，為便于檢測分析，綜合考慮選擇280nm和450nm作為熒光檢測的激發(fā)波長和發(fā)射波長。2.2色譜柱的選擇分別比較了HydrosphereC18、PenomenexC18、DiamonsilC18、XTerraC18、InertsilC18等不同型號(hào)C18柱對(duì)14種沙星類抗生素的色譜分離情況，結(jié)果表明，HydrosphereC18（250mmx4.6mmx5pm）色譜柱可實(shí)現(xiàn)對(duì)14種沙星類抗生素的分離，且各分析物的色譜峰響應(yīng)值較高，峰形較好，故選擇HydrosphereC18作為分離色譜柱。其色譜分離情況見圖1。圖1沙星類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖2.3流動(dòng)相的選擇分別比較了甲醇/乙月青-水、甲醇/乙腈-磷酸鹽緩沖液、甲醇/乙月青-乙酸銨溶液等流動(dòng)相體系對(duì)14種沙星類抗生素的色譜分離情況。結(jié)果表明：甲醇/乙腈-水或甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，響應(yīng)值不高、不能實(shí)現(xiàn)基線分離；甲醇/乙腈-乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰拖尾嚴(yán)重；甲醇/乙腈-磷酸緩沖液作為流動(dòng)相時(shí)，響應(yīng)值較高，可實(shí)現(xiàn)基線分離，諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、加替沙星的色譜峰拖尾，但加入三乙胺后色譜峰拖尾現(xiàn)象消除；當(dāng)使用體積比85:15的甲醇/乙腈-0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.5）作為流動(dòng)相時(shí)，14種沙星類抗生素經(jīng)梯度洗脫后可有效分離，無拖尾峰，峰形尖銳且對(duì)稱，其色譜圖見圖1。2.4固相萃取柱的選擇鑒于大多數(shù)沙星類抗生素是酸堿兩性化合物，且具有較強(qiáng)的極性，分別考察了MCX（混合型陽離子）、MAX（混合型陰離子）、HLB（親水-親酯）、SIL（硅膠）、AluN（中性氧化鋁）、C18（反相）等不同型號(hào)固相萃取柱對(duì)14種沙星類抗生素的分離情況。結(jié)果表明：6種不同填料的固相萃取柱對(duì)沙星類抗生素的萃取率不同，按10次重復(fù)測量，萃取率在56.8%~95.4%，其中親水-親酯固相萃取柱HLB的萃取率較高，其對(duì)14種沙星類抗生素平均萃取率為93.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%，這可能是由于大多數(shù)沙星類抗生素是酸堿兩性化合物，且具有較強(qiáng)的極性，可與親水-親酯固相萃取柱HLB較好地進(jìn)行吸附和洗脫，從而其萃取率較高。故固相萃取柱選擇HLB柱。2.5金屬螯合劑的選擇由于部分沙星類抗生素（氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星等）可與污水中的Cu2+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Cr3+等金屬離子形成螯合物從而影響其提取率，故分析了二甲基二硫代氨基甲酸鈉（SDD）、乙二胺四乙酸鈉（Na2EDTA）、二乙基三胺五乙酸（DTPA）、氨基三亞甲基麟酸（ATMP）等不同金屬螯合劑對(duì)制藥工業(yè)污水中沙星類抗生素提取效率的影響。結(jié)果表明：（1）在制藥工業(yè)污水中加入一定量的金屬螯合劑后，雖出現(xiàn)絮狀沉淀，但有利于提高沙星類抗生素的提取率，尤其是采用Na2EDTA金屬螯合劑時(shí)，沙星類抗生素提取率最高。(2)隨著Na2EDTA加入量逐漸增大，沙星類抗生素提取率呈現(xiàn)遞增并逐漸飽和趨勢，這可能是由于Na2EDTA與沙星類抗生素都對(duì)污水中金屬離子發(fā)生螯合作用，但Na2EDTA螯合作用較強(qiáng)，通過螯合誘導(dǎo)打破沙星類抗生素與金屬離子的平衡，釋放出游離的沙星類抗生素，從而提高沙星類抗生素提取率；當(dāng)Na2EDTA加入質(zhì)量為1g時(shí)，沙星類抗生素提取率高達(dá)98.7%。故選擇Na2EDTA金屬螯合劑，且加入質(zhì)量為1g。2.6線性范圍、方法檢出限和測定下限將不含目標(biāo)物的制藥工業(yè)廢水作為溶劑，依次配制質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0mg/L的14種沙星類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行HPLC測定，以色譜峰峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以沙星類抗生素的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見表2。表2線性范圍、檢出限、回收率和精密度序號(hào)化合物回歸方程線性范圍/(mg-L-1)相關(guān)系數(shù)方法檢出限/(mg-L-1)1NORy=86.66x-0.020.1~100.00.99980.0252CIPy=230.66x-0.360.1~100.00.99930.0173LOMy=68.53x-0.560.1~100.00.99920.0124DNFy=338.63x+0.660.1~100.00.99960.0075ENRy=38.28x+0.060.1~100.00.99920.0126SARy=302.28x+0.620.5~100.00.99950.0707DANy=326.26x-0.020.5~100.00.99940.0298PEFy=362.56x+0.660.5~100.00.99960.0359ENOy=326.62x-0.060.1~100.00.99980.01510OFLy=25.62x-0.320.1~100.00.99920.02311SPAy=26.26x-0.020.5~100.00.99920.02712DFXy=66.62x-0.060.1~100.00.99930.02113GTFy=565.63x-0.060.1~100.00.99990.00514ORBy=60.66x+0.650.5~100.00.99930.048測定下限/(mg-L-1)0.10.0680.0480.0280.0480.280.1160.140.060.0920.1080.0840.020.192平均回收率/%96.393.792.692.397.491.398.193.292.892.197.990.792.493.7RSD/%1.82.51.72.32.21.91.93.22.12.31.91.51.12.3依據(jù)國家環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ168—2010），重復(fù)11次空白試驗(yàn)，測定11次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算方法檢出限（MDL），并以4倍檢出限作為測定下限。由表2可知，沙星類抗生素在0.5~100.0mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，且相關(guān)系數(shù)＞0.9992。14種沙星類抗生素的方法檢出限為0.005~0.070mg/L,測定下限為0.02~0.28mg/L。2.7回收率和精密度取空白基質(zhì)制藥工業(yè)廢水進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度按低中高3個(gè)水平分別設(shè)為0.5、50.0、100.0mg/L,按上述所建HPLC法進(jìn)行測定，每個(gè)水平重復(fù)測定6次，結(jié)果見表2。可知14種沙星類抗生素的平均回收率為90.7%~98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%~3.2%。2.8實(shí)際樣品的測定采用本研究所建HPLC法，對(duì)30份實(shí)際制藥工業(yè)廢水進(jìn)行14種沙星類抗生素種類和含量快速篩查。結(jié)果表明：30份所檢制藥工業(yè)廢水中，6份廢水呈陽性檢出沙星類抗生素，6份廢水均來源于抗生素制藥廠廢水池，其余24份廢水呈陰性，廢水來源于合成藥物生產(chǎn)廢水、中成藥生產(chǎn)廢水。6份呈陽性廢水檢出的沙星類抗生素主要為：氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、洛美沙星等，尤其是氧氟沙星檢出率最高，且檢出殘留量最高達(dá)5.28mg/L,RSD為1.2%，檢出氧氟沙星樣品的液相色譜圖如圖2所示。這可能是由于氧氟沙星自上市以來，以其高效、廣譜、安全等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，是目前臨床上最常用的抗菌藥物之一。圖2某陽性樣品高效液相色譜圖2.9與現(xiàn)有分析方法的比較對(duì)比本研究的HPLC法與文獻(xiàn)報(bào)道的分析方法〔18-22〕，結(jié)果見表3。由表3可知，本方法所用HPLC儀器設(shè)備普遍易得、操作簡便，與文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法相比，同時(shí)測定的沙星類抗生素種類較多，回收率高、精密度好，且加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合《化學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制比對(duì)試驗(yàn)》(RB/T208—2016)和《檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià)檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)通用要求》(RB/T214—2017)的要求。表3不同分析方法比較樣品儀器沙星類抗生素回收率/%RSD/%檢出限水LC-MS/MS〔18〕5種81.5-1166.0-14.10.3~1.0叫兒污水LC-MS/MS〔19〕8種73.8-1132.6-13.20.2-1.0ng/L雞糞HPLC〔20〕6種76.7-106.70.7-14.40.002-0.022mg/kg±壤HPLC〔21〕4種60.4-99.32.6-13.20.58-1.0pg/kg化妝品HPLC〔22〕19種75.5-105.10.4-1.11.2-14.7mg/kg污水HPLC(本研究)14種90.7-98.11.1-3.20.005-0.070mg/L3結(jié)論研究建立了制藥工業(yè)廢水中14種沙星類抗生素殘留的高效液相色譜法同時(shí)分析方法，與其他分析方法相比，該方法具有樣品前處理操作簡便、回收率高、精密度好，可同時(shí)測定多種沙星類抗生素，適用于制藥工業(yè)廢水中同時(shí)測定多種沙星類抗生素殘留量。參考文獻(xiàn)【相關(guān)文獻(xiàn)】[1]萬志龍，劉明亮.莫西沙星的安全性評(píng)價(jià)[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2006,27(3):105-109.[2]YiYilei,JianJianbing,ChengXiangwei,etal.Fluoroquinolonederivativesandtheiranti-tubercularactivities[J].EuropeanJournalofMedicinalChemistry,2018,146(2):554-563.[3]WangLu,QiangZhimin,LiYangang,etal.Aninsightintotheremovaloffluoroquinolonesinactivatedsludgeprocess:Sorptionandbiodegradationcharacteristics[J].JournalofEnvironmentalSciences,2016,56(6):263-271.[4]RiazL,MahmoodT,KhalidA,etal.Fluoroquinolones(FQs)intheenvironment:Areviewontheirabundance,sorptionandtoxicityinsoil[J].Chemosphere,2017,191(1):704-720.[5]王犇，朱現(xiàn)波，趙倩，等.負(fù)載型Fenton催化劑處理有機(jī)廢水的研究進(jìn)展[J].工業(yè)水處理，2016,36(12):6-11.[6]陳建發(fā)，林誠，劉福權(quán).復(fù)合工藝處理以抗生素類制藥為主的混合工業(yè)廢水[」].工業(yè)水處理，2014,34(10):91-94.[7]吳銀寶，汪植三，廖新佛，等.恩諾沙星對(duì)小型模型水生態(tài)系統(tǒng)中微生物的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2006,26(8):2640-2645.[8]王加龍，劉堅(jiān)真，陳杖榴，等.恩諾沙星殘留對(duì)土壤微生物功能的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2003,25(2):279-282.汪雪雁.分子印跡固相萃取-高效毛細(xì)管電泳法檢測雞肉中的恩諾沙星殘留[J].色譜，2010,28(11):1107-1110.宋佩，孟萌,EreminSA，等.熒光偏振免疫分析方法快速檢測沙拉沙星殘留[J].分析化學(xué),2012,40(8):1247-1251.[11]賈濤.UPLC檢測飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星[」].飼料研究，2012(10):71-74.[12]徐穎.HPLC法測定鹽酸莫西沙星含量及其有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,43(1):46-50.[13]陳曉紅.HPLC-FLD同時(shí)測定全血中加替沙星和莫西沙星含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2009,26(5):412-414.[14]方邢有，張德云，邵秋榮