基因工程-2-工具酶

第二章基因工程的工具酶第一節(jié)限制性內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶第五節(jié)DNA修飾酶第一節(jié)限制性內(nèi)切酶一、寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象二、II型限制性內(nèi)切酶的特性三、II型限制性內(nèi)切酶切割類型四、II型限制性內(nèi)切酶重要概念五、限制內(nèi)切酶的命名

第一節(jié)限制性內(nèi)切酶定義:能夠識(shí)別和切割雙鏈DNA(dsDNA)分子內(nèi)特異核苷酸順序的核酸內(nèi)切酶,叫做限制性核酸內(nèi)切酶.主要特征I型II型III型切割位點(diǎn)距寄主特異性位點(diǎn)至少數(shù)百bp的部位可能隨機(jī)的切割位于寄住特異性位點(diǎn)或兩側(cè)距寄住特異性位點(diǎn)3’端24-26bp處序列特異的切割不是是是三種類型核酸內(nèi)切酶特性差異GAATTCCTTAAG5’

3’3’

5’限制作用修飾作用GAATTCCTTAAG5’AATTCCTTAA5’

G3’3’G5’

3’3’

5’3’

5’5’

3’＋EcoRIMEcoRIMeMe核酸內(nèi)切限制酶EcoRI及其修飾的甲基化酶MEcoRI的限制與修飾作用

EcoRI識(shí)別序列經(jīng)MEcoRI甲基化之后，就再不能被EcoRI所切割一、寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制和修飾的作用保護(hù)自身的DNA不受限制破壞外源DNA使之迅速降解一般識(shí)別和切割4和6個(gè)核苷酸順序,少數(shù)為5、7個(gè)核苷酸,也有識(shí)別8個(gè)核苷酸的,但無(wú)4個(gè)以下的:

Sau3A

BamHⅠ5’……G-A-T-C-A-G-G-A-T-C-C……3’3’……C-T-A-G-T-C-C-T-A-G-G……5’44=25646=409648=65536二、II型限制性內(nèi)切酶的特性4個(gè)6個(gè)λDNA49Kb12位點(diǎn)。BglII6個(gè)；BamHI5個(gè)；SalI2個(gè)。三、II型限制性內(nèi)切酶切割類型1、平齊末端（Bluntend）HindII切割反應(yīng)SmaI切割反應(yīng)2.1產(chǎn)生5’粘性末端

5’-GA-A-T-T-C-3’

3’C-T-T-A-A-G-5’5’-G-3’5’-A-A-T-T-C-3’

3’-C-T-T-A-A-5’3’-G-5’2.2產(chǎn)生3’粘性末端

5’-C-T-G-C-A-G-3’

3’-GA-C-G-T-C-5’5’-C-T-G-C-A-3’5’-G-3’

3’-G-5’3’-A-C-G-T-C-5’EcoRI＋＋PstI2、粘性末端（Stickyend）1、同裂酶指來(lái)源不同但識(shí)別相同序列且切割位點(diǎn)相同。HindIII和HsuI2、同位酶

識(shí)別相同的序列但切割位點(diǎn)不一樣。

C-C-C-G-G-GG-G-G-C-C-CA-A-G-C-T-TT-T-C-G-A-AC-C-C-G-G-GG-G-G-C-C-CC-C-C-G-G-GG-G-G-C-C-CSmaIXmaI四、II型限制性內(nèi)切酶重要概念3、同尾酶

這一類的限制酶來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列也不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。G-G-A-T-C-CC-C-T-A-G-GBamHIT-G-A-T-C-AA-C-T-A-G-TBclIA-G-A-T-C-TT-C-T-A-G-ABglIIG-A-T-CC-T-A-GSau3AIU-G-A-T-C-YY-C-T-A-G-UXhoIIU表示嘌呤（A或G）Y表示嘧啶（T或C）5‘-G-A-T-C3’--3‘C-T-A-G-5’+4、酶的星號(hào)活性

當(dāng)酶切條件改變時(shí)，酶的專一性可能會(huì)降低，以至于同一種酶可識(shí)別和切割多個(gè)的位點(diǎn)。低鹽（50mM）、高pH（>8）、高甘油濃度EcoRI*EcoRIG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GG-A-A-T-T-AC-T-T-A-A-TA-A-A-T-T-CT-T-T-A-A-GG-A-G-T-T-CC-T-C-A-A-G5、雙酶切方法同步雙酶切分步雙酶切1、命名三原則取屬名第一個(gè)大寫字母,種名前兩個(gè)小寫字母取變種、品系第一個(gè)字母構(gòu)成限制酶的名稱在同種生物中發(fā)現(xiàn)幾種酶,按先后順序用羅馬字母Ⅰ、Ⅱ…HaemophilusinfluenzaedIII屬名種名株型HindⅢBacillusamyloliquefaciensH淀粉液化芽胞桿菌EscherichiacoliR質(zhì)粒大腸桿菌

五、限制內(nèi)切酶的命名流感嗜血菌BamHⅠEcoRⅠDNA1μl(1μg)buffer(10×)2μlddH2O16μl限制性內(nèi)切酶1μl(1u)總體積20μlA）確定酶切DNA的量B）計(jì)算完全酶切所需的酶量。C）10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的1/10D）依次加入計(jì)算好的DNA量、10X反應(yīng)液、酶。六、限制內(nèi)切酶的反應(yīng)體系1.底物DNA1.1DNA純度:

1.1.1RNA與E結(jié)合影響有效酶濃度；1.1.2提取時(shí)混入雜質(zhì)可改變識(shí)別特異性。1.2DNA濃度:

[DNA]過(guò)大，抑制酶活，影響酶分子擴(kuò)散

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

七、影響限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的因素2.識(shí)別位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)特異性序列XmaⅢ切點(diǎn)（CGGCCG）在GGCGGCCGCC時(shí)不切割。3.DNA二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)

如：超螺旋DNA(病毒或質(zhì)粒)比線狀DNA需酶多酶切1ugλDNA，需要1-2單位的酶;酶切1ug質(zhì)粒DNA，需要3-5單位的酶。

4.反應(yīng)系統(tǒng)因素（1）緩沖液（無(wú)菌、無(wú)污染）（2）金屬離子（3）牛血清蛋白(BSA)

（4)溫度與反應(yīng)時(shí)間1.DNA重組

2.構(gòu)建載體

3.DNA順序分析

4.遺傳病診斷八、限制內(nèi)切酶的應(yīng)用

/rebase/rebase.html第二節(jié)DNA連接酶

定義：能夠催化雙鏈分子中相鄰的3’-OH和5’-P末端之間形成磷酸二酯鍵,使DNA分子連接起來(lái)的酶.一、種類

1.1T4-DNA連接酶—從T4噬菌體感染的大腸桿菌提取1.2大腸桿菌DNA連接酶二、DNA連接酶的連接范圍

1.粘性末端DNA連接2.缺口的填補(bǔ)3.平末端DNA連接5’3’3’5’5’3’3’5’PPOHOH5’3’3’5’POHRNADNA5’3’3’5’OHOHPP5’3’3’5’5’3’3’5’Mg2+,ATPMg2+,ATPMg2+,ATPT4-DNA連接酶T4-DNA連接酶T4-DNA連接酶T4-DNA連接酶各種催化反應(yīng)活性三、DNA連接酶的連接條件

1.雙鏈DNA分子2.具有3’-OH和5’-P3.缺口處不缺核苷酸缺失核苷酸的裂口丟失磷酸二酯鍵的缺口3’5’連接酶封閉缺口連接酶無(wú)法封閉缺口無(wú)活性（a）（b）四、DNA連接酶的連接反應(yīng)機(jī)制：3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’產(chǎn)生一個(gè)磷酸二酯鍵Amp酶-Amp酶T4連接酶ATPppiAmp與P反應(yīng)OHP①T4DNA連接酶與ATP形成酶-Amp復(fù)合物PPA②酶-Amp復(fù)合物再結(jié)合到具5’-P和3’-OH切口的DNA上，使DNA腺苷化

③產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封閉起來(lái)，完成連接作用。PPPPPPPPPPP五、T4DNA連接酶的反應(yīng)條件10×T4DNALigaseBuffer2.5μl

DNA片段*約0.3pmol

載體DNA**約0.03pmol

T4DNALigase1μlddH2Oupto25μl

反應(yīng)溫度16度，連接過(guò)夜。*DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3～10倍。指在DNA模板指導(dǎo)下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3’-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。

一、種類聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA損傷修復(fù)，在半保留復(fù)制中起輔助的作用

聚合酶Ⅱ（polⅡ），在修復(fù)損傷中有重要的作用聚合酶Ⅲ（polⅢ），DNA復(fù)制過(guò)程中起主要作用

聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。第三節(jié)DNA聚合酶二、DNA聚合酶的特點(diǎn)：

1.需模板DNA；2.需