電泳技術(shù)和蛋白質(zhì)測(cè)定

電泳技術(shù)

在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

電泳是帶電荷的膠體顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)。

凈電荷：生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒形式分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度與其他大分子的相互作用。電場(chǎng)支持介質(zhì)電泳的三要素

以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的電泳法稱為凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

凝膠電泳要點(diǎn)內(nèi)容影響DNA在瓊脂糖凝膠電泳遷移速率的原因有哪些？Westernblotting的基本試驗(yàn)環(huán)節(jié),及每一步的操作意義。瓊脂糖（agarose）是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其構(gòu)造單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其他力的作用使其相互盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成直徑從50nm到略不小于200nm的三維篩孔的通道。

瓊脂糖凝膠電泳

凝膠中的瓊脂糖含量[%（w/v）]線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~32.00.1~2瓊脂糖濃度：根據(jù)被分離線狀DNA片斷的大小選擇凝膠的制備

以瓊脂糖為溶質(zhì)，電泳緩沖液為溶劑，配制一定濃度的溶膠，加熱煮沸，冷卻到50度左右，灌入水平膠框，插入梳子。緩沖液系統(tǒng)常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等。

樣品配制與加樣

DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)具有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，以及10～15%蔗糖或5～10%甘油，以增長(zhǎng)其比重，使樣品集中。電泳在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。所以，為了取得電泳分離DNA片段的最大辨別率，所用電壓不宜高于5V/cm。cm：電場(chǎng)正負(fù)極間的距離。

染色和拍照

常用熒光染料溴化乙錠(EB)染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

溴化乙錠(EB)具有一種能夠嵌入DNA或RNA的堆砌堿基之間的一種平面基團(tuán)，與核酸結(jié)合后在紫外線激發(fā)下呈現(xiàn)橘黃色熒光，熒光的位置代表核酸片段所在的位置，熒光的強(qiáng)弱代表核酸量的多少,能夠檢測(cè)到少至10ng的DNA條帶?？捎糜跈z測(cè)單鏈或雙鏈核酸(DNA和RNA)。 將一系列已知分子量的原則DNA的遷移率與其相應(yīng)的分子量對(duì)數(shù)作圖，可取得一條原則曲線，未知DNA片段與其在相同條件下進(jìn)行電泳，經(jīng)過(guò)原則曲線，利用電泳遷移率即可求得其分子量。雙鏈DNA分子在凝膠電泳中的遷移率與其堿基對(duì)數(shù)目的常用對(duì)數(shù)成反比。影響DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率的原因DNA分子的大小瓊脂糖濃度DNA的構(gòu)象：超螺旋環(huán)狀(I型)、切口環(huán)狀(II型)和線狀(III型)；共價(jià)閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開(kāi)環(huán)雙鏈DNA。所用的電壓：低電壓時(shí)，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比；電場(chǎng)強(qiáng)度升高時(shí)，高分子質(zhì)量片段的遷移率遂不成百分比的增長(zhǎng)。電泳緩沖液溴化乙錠聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N‘一四甲基乙二胺)和過(guò)硫酸銨的作用下，聚合形成聚丙烯酰胺長(zhǎng)鏈，進(jìn)一步在交聯(lián)劑N，N’一亞甲雙丙烯酰胺參加下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。與瓊脂糖凝膠電泳的比較,PAGE的特點(diǎn)

最適合分離小片段DNA(5～500bp),能夠分離蛋白質(zhì)；辨別力很強(qiáng)，長(zhǎng)度上相差1bp的DNA即可分開(kāi)；聚丙烯酰胺凝膠一律進(jìn)行垂直電泳；裝載更多的DNA量；從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可合用于要求最高的試驗(yàn)(如胚胎注射)。瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基磺酸鈉)，SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)構(gòu)造，同步，在強(qiáng)還原劑(beta-巰基乙醇)作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。蛋白質(zhì)在一定濃度的具有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按百分比結(jié)合(多肽和SDS的質(zhì)量比為1:1.4)，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，所帶的負(fù)電荷大大超出了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差別。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長(zhǎng)的橢圓棒，它們的短軸是恒定的，而長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成百分比。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)亞基分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在15～200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。在不連續(xù)緩沖體系中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液；不連續(xù)緩沖體系具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故提升了SDS的辨別力；系統(tǒng)中全部組分都具有0.1%的SDS。SDS的特點(diǎn)負(fù)極積層膠分離膠正極配置積層膠分離膠丙烯酰胺濃度5%10-15%Tris-HCl1M，PH=6.81.5M，PH=8.8SDS，過(guò)硫酸銨，TEMED濃度相同電泳積層膠分離膠電壓80V120VTris-甘氨酸電泳緩沖液(pH8.3)的電離情況甘氨酸→帶負(fù)電的蛋白質(zhì)亞基→Cl-帶負(fù)電的蛋白質(zhì)亞基→甘氨酸-→Cl-蛋白質(zhì)亞基的電離情況蛋白質(zhì)亞基不被分離，而是被壓縮為最小體積蛋白質(zhì)亞基根據(jù)分子量的大小被分離

考馬斯亮藍(lán)染色(0.1-1.0ug的多肽)One-DimensionalSDS

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在等電點(diǎn)pI時(shí)，蛋白質(zhì)正負(fù)電荷量相等，凈電荷為零。和pI相比，在堿性溶液中成陰離子，在酸性溶液中成陽(yáng)離子。等電聚焦電泳IsoelectricFocusing(IEF)利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一種由陽(yáng)極到陰極逐漸增長(zhǎng)的pH梯度。在此體系中，不同蛋白質(zhì)即移動(dòng)、匯集于其相應(yīng)的pI位置，形成一種很窄的區(qū)帶。區(qū)帶的位置是由pH梯度的分布和蛋白質(zhì)的pI所決定，而與蛋白質(zhì)分子的大小和形狀無(wú)關(guān)。

電泳時(shí)可將樣品置于凝膠的任何位置；初始位置在負(fù)極時(shí)，因pH＞pI，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電，電泳時(shí)向正極移動(dòng)；移動(dòng)過(guò)程中，pH逐漸下降，所帶負(fù)電荷量逐漸降低，蛋白質(zhì)移動(dòng)速度減慢；當(dāng)移動(dòng)到pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，蛋白質(zhì)即停止移動(dòng)。Two-DimensionalSDSPI(byisoelectricfocusing–IEF)Approximatemolwt.(bySDSPAGE)SDS成果凝膠電泳blotting固相支持物探針?lè)磻?yīng)成果分析印跡法(blotting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種措施。Westernblotting1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，并利用雜交檢測(cè)特定的DNA片段的措施，稱為Southern印跡法。對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法。對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法。對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。WesternBlotting

基本原理在電場(chǎng)的作用下，將經(jīng)過(guò)SDS電泳分離的待測(cè)多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后利用這種多肽的特異抗體看待測(cè)分子檢測(cè)。蛋白提取SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗作用標(biāo)識(shí)二抗作用成果檢測(cè)Westernblotting基本環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)膜：將凝膠和固相支持物像三明治一樣夾在用緩沖液濕潤(rùn)的濾紙之間，在電場(chǎng)的作用下，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物。

正極三層濾紙硝酸纖維素濾膜凝膠三層濾紙負(fù)級(jí)

轉(zhuǎn)膜效果檢測(cè)麗春紅S染色（硝酸纖維素濾膜）預(yù)染蛋白marker考馬斯亮藍(lán)染色（SDS-聚丙烯酰胺凝膠）抗體孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液與濾膜溫育，4℃過(guò)夜。棄掉一抗溶液，用PBST(或TBST)漂洗濾膜3次，每次10min。加入二抗溶液，搖床上緩慢搖動(dòng)，37℃2小時(shí)。棄掉二抗溶液，用PBST(或TBST)漂洗濾膜3次，每次10min。封閉膜上的空白位點(diǎn)脫脂奶粉(5％)BSA(牛血清白蛋白)成果檢測(cè):二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過(guò)氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）蛋白檢測(cè)方法特點(diǎn)應(yīng)用蛋白印跡蛋白質(zhì)亞基、修飾的檢測(cè)信號(hào)通路中功能分子的研究放射性免疫分析微量蛋白質(zhì)（尤其是體液）的定量檢測(cè)受放射性核素半衰期的制約，科研研究中受到一定的限制，臨床應(yīng)用較廣。放免試劑盒的種類比較少。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測(cè)定微量蛋白質(zhì)（尤其是體液）的定量檢測(cè)，適用于大樣本批量檢測(cè)科研研究廣泛使用；ELISA試劑盒種類比較多。免疫組織細(xì)胞化學(xué)保留組織細(xì)胞固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可以對(duì)靶蛋白質(zhì)定位細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的分析蛋白檢測(cè)常用的試驗(yàn)措施放射性免疫分析（radioimmunoassay,RIA）將具有高敏捷度的放射性核素（如125I）示蹤技術(shù)與高特異性的免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合，建立的一種體外超微量蛋白質(zhì)分析法。用于定量測(cè)定受檢標(biāo)本中的蛋白質(zhì)，尤其合用于微量蛋白質(zhì)、激素和多肽的定量測(cè)定。探討內(nèi)容：基本原理基本試劑應(yīng)用基本原理1、標(biāo)識(shí)抗原(Ag*)、非標(biāo)識(shí)抗原(Ag)和特異性抗體(Ab)三者同步存在于一種反應(yīng)體系，標(biāo)識(shí)抗原和非標(biāo)識(shí)抗原(原則品或待測(cè)樣本)對(duì)特異性抗體具有相同的結(jié)合力，兩者相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合限量的特異性抗體。Ag*+Ab?Ag*Ab+Ag?AgAb

2、標(biāo)識(shí)抗原和抗體的量是固定的，非標(biāo)識(shí)抗原是變化的。標(biāo)識(shí)抗原與非標(biāo)識(shí)抗原與限量的抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。反應(yīng)達(dá)成平衡時(shí)，標(biāo)識(shí)抗原抗體復(fù)合物形成的量就伴隨非標(biāo)識(shí)抗原的量而變化。非標(biāo)識(shí)抗原量增長(zhǎng)，相應(yīng)地結(jié)合較多的抗體，從而克制標(biāo)識(shí)抗原對(duì)抗體的結(jié)合，使標(biāo)識(shí)抗原抗體復(fù)合物相應(yīng)降低。反應(yīng)達(dá)成平衡時(shí)，標(biāo)識(shí)抗原抗體復(fù)合物的放射性強(qiáng)度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈反比；而游離的標(biāo)識(shí)抗原放射性強(qiáng)度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈正比。

3、將Ag*Ab與游離Ag*分開(kāi)，分別測(cè)定其放射性強(qiáng)度，就可算出結(jié)合態(tài)的Ag*(B)與游離態(tài)的Ag*(F)的比值(B/F)，或算出其結(jié)合率[B/(B＋F)]。用一系列不同劑量的原則抗原進(jìn)行反應(yīng)，計(jì)算相應(yīng)的B/F，能夠繪制出一條劑量反應(yīng)曲線(競(jìng)爭(zhēng)克制曲線)。4、受檢標(biāo)本在一樣條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算B/F值，即可在劑量反應(yīng)曲線上查出標(biāo)本中抗原的含量。劑量反應(yīng)曲線

基本試劑1、原則品原則品是放射免疫分析法定量的根據(jù)，原則抗原的基本要求：原則抗原與待測(cè)抗原的免疫性必須一致，即它們與抗體的親和力和特異性相同?？乖兌缺仨毟?。原則抗原的量必須精確。原則抗原應(yīng)有很好的穩(wěn)定性。2、標(biāo)識(shí)物①比放射性高，以確保措施的敏捷度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡量長(zhǎng)，標(biāo)識(shí)一次可較長(zhǎng)時(shí)間使用，這對(duì)來(lái)之不易的抗原尤其主要；④標(biāo)識(shí)簡(jiǎn)便、易防護(hù)。標(biāo)識(shí)用的放射核素有γ射線和β射線兩大類。β射線有14C、3H和32P；γ射線主要為131I、125I、57Cr和60Co，125I是目前常用的RIA標(biāo)識(shí)物。3、抗體抗血清中具有對(duì)其相應(yīng)抗原的特異性抗體。目前常以抗原免疫年輕、健康的純種小動(dòng)物而誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體，選用特異性高、親和力強(qiáng)及滴度高的血清，為RIA所用。4、緩沖液目前最常用的緩沖液有下列幾種：①磷酸鹽緩沖液；②醋酸鹽緩沖液；③Tris–HCl緩沖液；④硼酸緩沖液。其中以磷酸鹽緩沖液應(yīng)用最多。

5、B與F分離在RIA反應(yīng)中，標(biāo)識(shí)抗原和特異性抗體的含量極微，所以需用一種合適的沉淀劑使它徹底沉淀，以完畢與游離標(biāo)識(shí)抗原（F）的分離。非特異性分離法(1)吸附法：利用表面活性物質(zhì)將反應(yīng)液中的小分子游離部分F吸附，經(jīng)過(guò)離心，將F沉淀，使大分子結(jié)合物B留在上清液中，而達(dá)成分離的目的。如:活性炭+葡聚糖吸附法。(2)過(guò)濾法：反應(yīng)液中B與F混合物在經(jīng)過(guò)一定規(guī)格孔徑的濾膜時(shí)，大分子不會(huì)經(jīng)過(guò)濾膜孔被阻留在濾膜上，小分子游離的放射性物質(zhì)F被抽吸經(jīng)過(guò)濾膜而分離。

(3)聚乙二醇(PEG)沉淀法：用PEG溶液替代第二抗體作沉淀劑。PEG沉淀的主要優(yōu)點(diǎn)是制備以便，沉淀完全。缺陷是非特異性結(jié)合率比用第二抗體高，且溫度高于30℃時(shí)沉淀物輕易復(fù)溶。特異性分離法在抗原與特異性抗體反應(yīng)后加入第二抗體，形成由抗原－第一抗體－第二抗體構(gòu)成的雙抗體復(fù)合物。為提升分離效果,分離時(shí)加入一定量的與一抗同種動(dòng)物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見(jiàn)的沉淀物，與上述抗原的雙抗體復(fù)合物形成共沉淀。雙抗體法具有特異、高效、非特異性結(jié)合低、反復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用1、心血管功能類：血栓素(TXB2)——消炎痛-EDTA抗凝6-酮-前列腺素F1α——消炎痛-EDTA抗凝內(nèi)皮素ET——抑肽酶-EDTA抗凝降鈣素基因有關(guān)肽——抑肽酶-EDTA抗凝心鈉素ANP——抑肽酶-EDTA抗凝腎上腺髓質(zhì)素ADM——抑肽酶-EDTA抗凝醛固酮——肝素抗凝應(yīng)用2、多肽因子類：TNF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、粒細(xì)胞-集落細(xì)胞刺激因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、紅細(xì)胞生成素(EPO)等。3、腦-腸肽類

胃動(dòng)素(MTL)——抑肽酶-EDTA抗凝神經(jīng)降壓素(NT)——抑肽酶-EDTA抗凝神經(jīng)肽(NPY)——抑肽酶-EDTA抗凝胃泌素——血清應(yīng)用4、骨代謝類骨鈣素(BGP)——血清；降鈣素(CT)——血清甲旁素有關(guān)肽——抑肽酶-EDTA抗凝5、甲狀腺功能類游離T3、游離T4、甲狀腺球蛋白TG、總T3、總T4。6、腫瘤檢測(cè)類甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、鐵蛋白、β2微球蛋白7、糖尿病類胰島素、胰高血糖素、胰島素抗體、C-肽8、嗎啡、葉酸、維生素、性激素類EnzymeLinkedImmunosorbentAssay（ELISA）將過(guò)量抗體（抗原）包被于載體上，經(jīng)過(guò)抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)識(shí)抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌清除游離的酶標(biāo)識(shí)抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物從而擬定待測(cè)物的存在與含量?？捎糜跍y(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。ELISA基本過(guò)程1、包被：抗體(抗原)吸附在固相載體上2、復(fù)合物的形成：加待測(cè)抗原(抗體),再加相應(yīng)酶標(biāo)識(shí)抗體(抗原),生成抗體(抗原)--待測(cè)抗原(抗體)--酶標(biāo)識(shí)抗體的復(fù)合物。3、酶與底物反應(yīng)：經(jīng)過(guò)酶和底物反應(yīng)，將待測(cè)抗原(抗體)的量轉(zhuǎn)化為溶液顏色的不同深度。4、檢測(cè)：溶液顏色的深淺經(jīng)過(guò)酶標(biāo)儀讀取OD值，這么，待測(cè)抗原(抗體)的量和OD值大小有關(guān)聯(lián)。ELISA常用類型類型固相載體上的包被物待測(cè)物酶標(biāo)記物顯色程度與待測(cè)物含量間的關(guān)系雙抗體夾心法（一步法）抗體A抗原酶標(biāo)抗體B正相關(guān)間接法抗原抗體酶標(biāo)二抗正相關(guān)競(jìng)爭(zhēng)法抗原（抗體）抗體（抗原）酶標(biāo)抗體（抗原）負(fù)相關(guān)捕獲法抗IgMIgM酶標(biāo)抗體正相關(guān)加底物洗滌受檢標(biāo)本酶標(biāo)抗體B洗滌保溫洗滌保溫固相抗體抗原抗體A酶標(biāo)抗體B

酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值利用待測(cè)抗原上的兩個(gè)抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)識(shí)抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原含量成正比。此法合用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不合用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原。雙抗體夾心法測(cè)抗原固相抗原洗滌受檢血清洗滌酶標(biāo)抗抗體抗原抗體抗抗體酶標(biāo)洗滌加底物保溫保溫酶標(biāo)儀檢測(cè)

OD值間接法測(cè)抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的量與待測(cè)抗體量成正比。利用特異性病原體抗體，而進(jìn)行傳染病的診療。優(yōu)點(diǎn):只要變換包被抗原，就能夠利用同一酶標(biāo)二抗建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的措施。

競(jìng)爭(zhēng)法用酶標(biāo)抗原(抗體)與待測(cè)的非標(biāo)識(shí)抗原(抗體)競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的限量抗體(抗原)結(jié)合，待測(cè)抗原(抗體)多，則形成非標(biāo)識(shí)復(fù)合物多，酶標(biāo)復(fù)合物就少，故顯色程度與待測(cè)物含量成反比。用于小分子激素、藥物等測(cè)定。

加底物酶標(biāo)抗原受檢標(biāo)本酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值固相抗體抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)抗原待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與限量抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合捕獲包被法測(cè)抗體(IgM)

抗原酶標(biāo)抗體洗滌保溫受檢血清洗滌抗原保溫抗IgM固相抗體抗IgM抗體IgM抗原酶標(biāo)抗體加底物酶標(biāo)儀檢測(cè)

OD值先用抗IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM(其中涉及針對(duì)抗原的特異性IgM和非特異IgM)，然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合，再加酶標(biāo)識(shí)針對(duì)抗原的特異性抗體，最終加入底物作用，溶液呈色即與標(biāo)本中特異性IgM的量成正有關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診療。原則品濃度X吸光度（OD)Y10 2.2575 1.6512.5 1.0491.25 0.6050.625 0.3560.3125 0.2390.156 0.1640 0.074Hill曲線擬合方程:y=ymax*x^n/(k^n+x^n)ymax=3.46032k=6.00154n=1.06288r^2=0.99252免疫細(xì)胞化學(xué)（一）標(biāo)本的搜集與處理1、組織標(biāo)本的取材與儲(chǔ)存起源：活檢取材、手術(shù)切除、試驗(yàn)動(dòng)物組織等。要求：要快、要小(1×1×0.4cm)、防止擠壓。處理：冰凍→冰凍切片；固定→石蠟切片。2、細(xì)胞標(biāo)本的取材與儲(chǔ)存起源：血細(xì)胞、穿刺細(xì)胞、體液細(xì)胞等。處理：細(xì)胞多時(shí)直接涂片、干燥、固定。細(xì)胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞

（二）固定1、固定的含義固定是用某種化學(xué)物質(zhì)使蛋白質(zhì)、酶類(變性)、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)保持在組織細(xì)胞原位，防止Ag溶解、擴(kuò)散、丟失；保持組織細(xì)胞的正常形態(tài)構(gòu)造。2、固定劑的選擇多糖冷的飽和苦味酸(750ml)甲醛(250ml)冰醋酸(50ml)核蛋白及核酸醋酸或三氯醋酸(TCA)酶丙酮蛋白質(zhì)10%的formalin或4%的多聚甲醛

（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片前三步只用于石蠟切片，冰凍切片不需此環(huán)節(jié)。1、常規(guī)石蠟包埋過(guò)程(1)脫水：75％、85％乙醇，95％乙醇，無(wú)水乙醇

(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蠟：石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ(4)石蠟包埋：脫水透明后，用石蠟、火棉膠、環(huán)氧樹(shù)脂等支持劑透入組織內(nèi)部使之變硬(利于切片)的過(guò)程。石蠟包埋適于絕大多數(shù)組織學(xué)和組化技術(shù)。(5)修蠟塊，標(biāo)號(hào)包埋2、切片石蠟切片：脫水、透明、浸蠟、包埋、切片5-7μm冰凍切片：浸糖:20%-30%蔗糖4℃過(guò)夜，降低冰晶；OCT(聚乙二醇+聚乙烯醇)包埋，液氮速凍，減輕組織破壞。病理切片要薄，5-7μm；腦片一般30-50μm，有利于追蹤神經(jīng)纖維的走行。(四)消除內(nèi)源性酶

①內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的消除措施：0.3～3%H2O2甲醇溶液浸泡20min②內(nèi)源性堿性磷酸酶的消除措施

左旋咪唑(24mg/ml)加入底物液中,并保持pH7.6-8.2。(七）免疫反應(yīng)1、一抗4℃過(guò)夜（或37℃2小時(shí)）。2、二抗37℃30分鐘。3、成果檢測(cè)①滴加底物在顯微鏡下顯色，適時(shí)終止。②熒光顯微鏡檢測(cè)（八）核染色：蘇木素復(fù)染或DAPI染色（九）脫水、透明、封片。腎小球磷酸化IKK免疫組化成果，200X

蛋白質(zhì)相互作用２００種蛋白質(zhì)及２０００種組合構(gòu)造進(jìn)行解析后，發(fā)覺(jué)其中三分之一的蛋白質(zhì)相互組合會(huì)造成疾病，輕易造成疾病的蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)結(jié)合后來(lái)也將變得十分活躍，致使發(fā)病和病情惡化。絕大多數(shù)疾病都是由１０萬(wàn)種以上的特定蛋白質(zhì)相互作用所致。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用和辨認(rèn)在諸如生物催化、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過(guò)程起著主要的作用。結(jié)構(gòu)域相關(guān)特點(diǎn)代表蛋白質(zhì)Set結(jié)構(gòu)域是一種介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的結(jié)構(gòu)域，已證明它可以與一種類似雙重特異磷酸酶蛋白家族作用Rb結(jié)合鋅指蛋白Sam結(jié)構(gòu)域是進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)節(jié)各種真核細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，可憑借SAM結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)形成同二聚體，或異源二聚體絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶Tpr結(jié)構(gòu)域由34個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分布廣泛，常構(gòu)成腳手架樣結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)蛋白質(zhì)作用，且常形成較大的復(fù)合體分裂后期啟動(dòng)復(fù)合體亞單位（cdc16,cdc23和cdc27）WD40結(jié)構(gòu)域在高等真核細(xì)胞G蛋白β亞單位中有8個(gè)隨機(jī)重復(fù)序列，每個(gè)由40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，而每一個(gè)都含有中央的Trp-Asp模塊，因而稱為WD40，該結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf）SRCR結(jié)構(gòu)域多見(jiàn)于細(xì)胞表面分子和一些分泌蛋白，功能是參與配體介導(dǎo)結(jié)合Mac2結(jié)合蛋白SH2結(jié)構(gòu)域由大約100個(gè)左右氨基酸構(gòu)成，含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以利用SH2結(jié)構(gòu)域與其靶肽上磷酸化的酪氨基酸殘基的高特異性的結(jié)合為調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈，這種作用是序列特異的，且是磷酸化依賴的STAT蛋白可能參加蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的構(gòu)造域蛋白質(zhì)相互作用的研究措施1.酵母雙雜交2.免疫共沉淀和GSTpulldown3.熒光共振能量轉(zhuǎn)移4.質(zhì)譜轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)造特點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子從功能上分析其構(gòu)造可包具有不同區(qū)域，①DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain)②轉(zhuǎn)錄激活域(activatingdomain)③連接區(qū)酵母激活因子GAL4：N端：147個(gè)氨基酸構(gòu)成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113個(gè)氨基酸構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域能夠和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。構(gòu)成部分：（1）與BD融合的蛋白體現(xiàn)載體，被體現(xiàn)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白體現(xiàn)載體，被其體現(xiàn)的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一種或多種報(bào)告基因的宿主菌株。酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwoHybrid原理BDXCOOHADcDNANH2

COOH共轉(zhuǎn)化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNAlibraryNH2Gal4Gal4雙雜交系統(tǒng)的原理LacZGal4激活域Gal4結(jié)合域Gal4結(jié)合域Gal4結(jié)合域LacZLacZGal4激活域LacZGal4激活域Gal4結(jié)合域XYXY酵母雙雜交系統(tǒng)：將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一種雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一種雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒(méi)有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD接近形成一種有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。所以可經(jīng)過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。

1）已知蛋白之間相互作用的檢測(cè)；2）蛋白質(zhì)的功能域研究：經(jīng)過(guò)對(duì)其中某一種蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感愛(ài)好的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”體現(xiàn)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫(kù)與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫(kù)，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感愛(ài)好蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測(cè)其蛋白質(zhì)序列。

酵母雙雜交系統(tǒng)作用

免疫沉淀（IP）是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種措施?？贵w與細(xì)胞裂解液或體現(xiàn)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，經(jīng)過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心搜集上清，上清中涉及抗體、目的蛋白和少許的雜蛋白。

免疫共沉淀免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白