利用酮康唑抗性突變選育氫化可松高轉(zhuǎn)化菌株

利用酮康唑抗性突變選育氫化可松高轉(zhuǎn)化菌株

風(fēng)化松樹具有抗炎、抗毒、抗過敏和對(duì)膠原疾病的治療作用，并在臨床上得到廣泛應(yīng)用。目前，國(guó)外工業(yè)化松是通過生物化學(xué)（17'羥基二甲酯-4-烯基酯，20-二羥基二甲酯-丁基）轉(zhuǎn)移到下游的。轉(zhuǎn)化率為90%，對(duì)基質(zhì)的硫酸酯收率為60%。中國(guó)工業(yè)化松的生產(chǎn)性細(xì)菌使用藍(lán)色梨霉菌（absidiacoeroua）。由于該菌株的羥基化酶異質(zhì)性較低，副產(chǎn)物多，產(chǎn)品分離困難?；瘜W(xué)松的轉(zhuǎn)化率約為70%，對(duì)基質(zhì)的硫酸酯收率約為45%。我們已經(jīng)開始了對(duì)新月彎孢霉菌種的選育及條件優(yōu)化等方面的工作,力圖用新月彎孢霉替代現(xiàn)有生產(chǎn)菌藍(lán)色梨頭霉,選育高轉(zhuǎn)化新月彎孢霉菌株仍是當(dāng)前研究工作的主要目標(biāo).本文利用紫外線誘變結(jié)合酮康唑抗性篩選的方法,提高了突變菌株的篩選效率,最終篩選到一株高轉(zhuǎn)化率的酮康唑抗性突變株KA-91,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究.1材料和方法1.1病毒新月彎孢霉(Curvularialunata)CL-114.1.2培養(yǎng)基的制備斜面培養(yǎng)基(ρ/gL-1):葡萄糖20,瓊脂20,土豆汁20%.種子培養(yǎng)基(ρ/gL-1):葡萄糖20,酵母膏5,蛋白胨5,黃豆粉10,pH6.5.發(fā)酵培養(yǎng)基:同種子培養(yǎng)基.菌絲培養(yǎng)基(ρ/gL-1):葡萄糖20,蛋白胨5,酵母膏5,KH2PO45,12°Bx麥芽汁10%,pH6.0.再生培養(yǎng)基(ρ/gL-1):(下層)葡萄糖10,酵母膏4,瓊脂15,0.6mol/LKCl,以6oBx麥芽汁制.(上層)瓊脂6,其余同下層.1.3u3000na2hpo4-nah2po4緩沖液的配制按文獻(xiàn)方法進(jìn)行.將制備好的原生質(zhì)體懸浮于含有6mol/LKCl的Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)高滲緩沖液中,稀釋至n/mL-1=1.0×106.1.4不同濃度酮康唑平板上的菌落生長(zhǎng)吸取0.1mL原生質(zhì)體懸液與含有不同濃度酮康唑的4mL上層再生培養(yǎng)基混合,傾注于下層再生培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)5d.觀察不同濃度酮康唑平板上的菌落生長(zhǎng)情況,未生長(zhǎng)菌落的酮康唑最低作用濃度即為酮康唑?qū)υ摼淖钚∫种茲舛?1.5酮康唑抗性突變株的構(gòu)建吸取濃度為n/mL-1=1.0×106的原生質(zhì)體懸液10mL于φ75的無菌培養(yǎng)皿內(nèi),于15W的紫外燈下,距離30cm照射一定時(shí)間,取1mL適當(dāng)稀釋后,吸取0.1mL與含有最小抑制濃度酮康唑的4mL上層再生培養(yǎng)基混合,傾注于下層再生培養(yǎng)基平板上,28℃避光培養(yǎng)5d,生長(zhǎng)出的菌落即為酮康唑抗性突變株.1.6加氫4.42,4-三角瓶、4.7.4,7.7,4.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.3.3.3,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7.7,7.7,7.7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7,7.7.7.7.7,7.7,7.7.7.7.7.7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.7.7.7,7.71.6.1搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)菌株斜面用無菌水制成n/mL-1=3×106的孢子懸液,取1mL接種于盛有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,28℃、180r/min搖床振蕩培養(yǎng)20h.然后以4%接種量接種于盛有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,28℃、180r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h,調(diào)節(jié)pH為6.5,投入0.1%的RSA,繼續(xù)培養(yǎng)至68h,測(cè)定氫化可的松轉(zhuǎn)化率.1.6.27L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐容積7L,裝液量4L,將種子以5%的接種量接種入,通風(fēng)量1?0.4,罐壓0.03mPa,發(fā)酵溫度28℃,攪拌轉(zhuǎn)速280r/min,通過調(diào)節(jié)空氣流量和攪拌轉(zhuǎn)速保持溶氧在50%～60%,培養(yǎng)20h,調(diào)節(jié)pH為6.5,用80%乙醇洄流至澄清的底物RSA按0.1%的投料量迅速投入罐中,繼續(xù)培養(yǎng)至68h,取樣測(cè)定氫化可的松轉(zhuǎn)化率.1.7可燃化劑松率測(cè)定高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行.2結(jié)果與討論2.1醇康唑侖最小限制濃度的測(cè)定按1.4方法測(cè)定,酮康唑?qū)L-114菌株的最小抑制濃度為10μmol/L.2.2突變株與原始菌株松轉(zhuǎn)化率的比較在含酮康唑的再生培養(yǎng)基平板上分離到136株抗性菌株,通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)其氫化可的松轉(zhuǎn)化率,其中有14株氫化可的松轉(zhuǎn)化率高于出發(fā)菌株,結(jié)果見表1.由表1可知,突變株KA-91的氫化可的松轉(zhuǎn)化率達(dá)到68.05%,為出發(fā)菌株的1.42倍.將KA-91菌株在PDA斜面連續(xù)轉(zhuǎn)接5代,其氫化可的松轉(zhuǎn)化率沒有發(fā)生明顯變化,說明該菌株遺傳特性穩(wěn)定.2.3葡萄糖濃度的確定改變發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類,經(jīng)搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后,測(cè)定氫化可的松的轉(zhuǎn)化率(圖1).結(jié)果表明,葡萄糖為最適碳源.進(jìn)一步確定葡萄糖的最適濃度,由圖2可知葡萄糖的濃度為22g/L時(shí)氫化可的松的轉(zhuǎn)化率最高.1.葡萄糖Glucose;2.麥芽糖Maltose;3.蔗糖Bagasse;4.乳糖Lactose;5.淀粉Starch;6.木糖Xylose;7.果糖Fructose;8.糊精Dextrin2.4混合氮源的確定改變發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的種類,經(jīng)搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),測(cè)定氫化可的松的轉(zhuǎn)化率(圖3).可以看出,酵母膏作為氮源獲得生物量最高,牛肉膏作為氮源氫化可的松轉(zhuǎn)化率最高,其次為酵母膏.因此,確定由牛肉膏和酵母膏組成的混合氮源為最適氮源.分別取不同濃度的牛肉膏和酵母膏進(jìn)行混合氮源實(shí)驗(yàn),由表2可知,牛肉膏5g/L,酵母膏4g/L時(shí),氫化可的松的轉(zhuǎn)化率最高.1玉米漿Cornsteepliquor;2黃豆粉Soybeanpowder;3蛋白胨Peptone;4牛肉膏Beefextract;5酵母膏Yeastextract;6硫酸銨Ammoniumsulfate;7氯化銨Ammoniumchloride;8硝酸銨Ammoniumnitrate2.5初始ph值對(duì)加氫可的松的影響按照2.3,2.4所確定的培養(yǎng)基,將初始pH值分別調(diào)為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5時(shí)的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖4所示(黑色線條表示).可見初始pH值為6.5時(shí)最利于氫化可的松的產(chǎn)生.轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的pH值(在投料前用6mol/LHCl或10%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至所需值)對(duì)氫化可的松轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果如圖4所示(空白線條表示),最適轉(zhuǎn)化pH值為6.5.2.6控制轉(zhuǎn)速搖床轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響如表3所示.在搖瓶發(fā)酵工藝中通風(fēng)量進(jìn)行分段控制,0～6h(菌體生長(zhǎng)初期)轉(zhuǎn)速控制在180r/min,6h后(菌體進(jìn)入快速生長(zhǎng)期)轉(zhuǎn)速提高到200r/min,并維持到甾體轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束可以獲得最高轉(zhuǎn)化率.2.77接種量和發(fā)酵溫度對(duì)酵母粉生長(zhǎng)和芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響分別將以培養(yǎng)18h、20h、22h、24h、26h、28h的種子以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h,投入0.1%底物RSA,轉(zhuǎn)化40h,測(cè)定氫化可的松轉(zhuǎn)化率(圖5).結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)22h時(shí)的種子對(duì)氫化可的松的生成最有利.將培養(yǎng)22h時(shí)的種子以1%～9%的不同接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h,投入0.1%底物RSA,繼續(xù)培養(yǎng)40h,測(cè)定氫化可的松轉(zhuǎn)化率(圖6).結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%接種量的種子對(duì)氫化可的松的生成最有利.在7L發(fā)酵罐中,在已確定的最適發(fā)酵條件下,菌株KA-91的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線如圖7所示.由圖7可知,菌體在8h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,發(fā)酵液pH值也有一定的下降,此階段菌體處于快速生長(zhǎng)期,生物量迅速增加.在24h,投入底物RSA,調(diào)節(jié)pH值至6.5,菌體進(jìn)入生物轉(zhuǎn)化階段.在24～28h,發(fā)酵液中幾乎沒有氫化可的松生成,在28h后,氫化可的松大量生成,到56h氫化可的松轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值.在此期間,pH值小幅的上升,當(dāng)pH值上升到7.5以上,菌體開始衰老甚至自溶,菌絲體轉(zhuǎn)化活性降低.這可能是因?yàn)閜H值對(duì)細(xì)胞色素P450酶的活性有影響,適宜的pH值有利于維系細(xì)胞色素P450酶的活性和穩(wěn)定性,但目前機(jī)理還不十分清楚,有待于進(jìn)一步研究.3誘導(dǎo)使用p450酮康唑是一種細(xì)胞色素P450抑制劑,酮康唑等唑類化合物可以通過未共享電子對(duì)與血紅素鐵形成Pπ-Dπ鍵作用以及可能將在P450中保守的半胱氨酸上的巰基(SH)電子密度推向血紅素鐵,成為血紅素的特別好的配體,從而與P450競(jìng)爭(zhēng)分子氧或底物,抑制P450活性.由此很自然地聯(lián)想到其抗性機(jī)制可能是P450酶發(fā)生位點(diǎn)的突變.點(diǎn)突變使遺傳密碼子改變,可導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)與功能改變,引起酶活/酶量的變化.在新月彎孢霉代謝RSA產(chǎn)生氫化可的松的過程中,底物RSA在11β羥化酶的作用下,實(shí)現(xiàn)11-β位羥基化,生成目標(biāo)產(chǎn)物氫化可的松.P450酶是11β羥化酶的關(guān)鍵酶,P450酶的活性強(qiáng)弱直接影響著甾體的轉(zhuǎn)化能力.新月彎孢霉細(xì)