有限采樣法預(yù)測(cè)cyp3a抑制肝組織中cdyp44p4抑制劑的研究

有限采樣法預(yù)測(cè)cyp3a抑制肝組織中cdyp44p4抑制劑的研究

為了評(píng)估不同個(gè)體的細(xì)胞色素p450（cytochromep450，cyp）的代謝活性，選擇合適的檢測(cè)藥物。通過(guò)建立恰當(dāng)?shù)乃幋鷦?dòng)力學(xué)指標(biāo)反映CYP表型,進(jìn)而評(píng)價(jià)肝臟的藥物代謝能力可望成為監(jiān)測(cè)肝臟代謝功能及制定臨床給藥方案的重要手段。咪噠唑侖(midazolam,MDZ)是評(píng)價(jià)人和大鼠CYP3A代謝活性的常用探針?biāo)幬?。體外研究發(fā)現(xiàn),MDZ的系統(tǒng)清除率(CLs)與肝臟CYP3A活性之間有著良好的相關(guān)性。然而,MDZ系統(tǒng)清除率的計(jì)算需要在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)采集多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿藥物濃度數(shù)據(jù),這種不便和花費(fèi)使其不能作為一種簡(jiǎn)便的常規(guī)方法來(lái)測(cè)量個(gè)體CYP3A的代謝活性,限制了其實(shí)際應(yīng)用。有限采樣法(limitedsamplingstrategy,LSS)采用稀疏血藥濃度數(shù)據(jù)點(diǎn),如兩個(gè)或三個(gè),代替全程采樣,已被用于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的估算、治療藥物給藥方案的監(jiān)測(cè)等方面。運(yùn)用LSS法對(duì)肝臟CYP3A處于不同程度抑制狀態(tài)下的隨機(jī)群體建立的MDZ清除率預(yù)測(cè)模型,是否可用于估算肝臟的代謝活性尚不清楚,因而有必要闡明LSS法在這種情況下的應(yīng)用。本研究通過(guò)給予大鼠特異性CYP3A抑制劑酮康唑(ketoconazole,KTZ)抑制CYP3A活性,以模擬肝臟代謝功能減低的情況。采用幾個(gè)不同劑量的KTZ得到不同穩(wěn)態(tài)血藥濃度以實(shí)現(xiàn)對(duì)CYP3A的持續(xù)抑制,以MDZ血藥濃度建立LSS模型預(yù)測(cè)MDZ清除率,并與實(shí)測(cè)值(觀察值)進(jìn)行比較,以探討LSS法評(píng)價(jià)抑制狀態(tài)下肝臟CYP3A代謝活性的可行性和準(zhǔn)確性。回歸方程的建立、檢測(cè)及模型驗(yàn)證藥品與試劑KTZ(浙江東亞制劑化學(xué)有限公司,批號(hào)20030313);MDZ注射劑(徐州恩華集團(tuán)藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),10mg/2mL/支,批號(hào)20030209);地西泮原料藥(大同制藥廠);無(wú)水甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。儀器Agilent1100HPLC工作系統(tǒng)(Agilent公司)。動(dòng)物雄性Wistar大鼠,8～12周齡,體重(253.7±11.4)g(SPF級(jí),中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證編號(hào)SCXK11-00-0006)。實(shí)驗(yàn)方案以PEG400-丙二醇(9∶1)為溶劑配制系列濃度的KTZ溶液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和低、中、高濃度抑制劑組。用25%烏拉坦麻醉后,抑制劑組經(jīng)舌靜脈分別注射負(fù)荷劑量為1.2、10和30mg·kg-1的KTZ后,立即經(jīng)尾靜脈分別以0.7、2.0和3.0mg·h-1·kg-1的速率恒速滴注KTZ溶液,以使其穩(wěn)態(tài)血藥濃度達(dá)到約1.49、7.16和36.25mg·L-1。對(duì)照組同法給空白溶劑。靜脈滴注KTZ后2h,以10mg·kg-1劑量經(jīng)舌靜脈給予MDZ注射液,30s內(nèi)給完。分別在給藥后2、5、10、20、30、45、60、90和120min經(jīng)大鼠股靜脈采血0.8mL,置肝素化試管中,3500r·min-1離心10min,分離血漿,置-20℃冰箱中儲(chǔ)存。色譜條件參考文獻(xiàn)建立HPLC檢測(cè)條件:C18反相色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)(淮陰精工廠);流動(dòng)相:甲醇-0.05mol·L-1磷酸氫二銨緩沖液(pH3.9;60∶40,v/v);流速:1.0mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):231nm;狹縫寬16nm;柱溫:45℃。血漿樣品預(yù)處理取血漿樣品250μL,依次加入5mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液50μL、1mol·L-1氫氧化鈉溶液500μL和重蒸正己烷5mL,以快速液體混合器混勻5min后3500r·min-1離心5min。取上層有機(jī)相4mL至玻璃離心管,置40℃水浴中以氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)昧鲃?dòng)相100μL復(fù)溶,進(jìn)樣20μL,記錄色譜圖。經(jīng)典藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)藥理專業(yè)委員會(huì)編制的實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)程序DAS軟件建立MDZ二房室模型并計(jì)算清除速率常數(shù)K10、消除半衰期T1/2β、表觀分布容積Vd、藥物濃度-時(shí)間曲線下面積AUC0-∞、清除率CLs等參數(shù),由此得到的CLs作為觀察值(CLobs)。One-WayANOVA和SNKt-test用于組間比較和統(tǒng)計(jì)推斷。LSS模型的建立對(duì)參數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),必要時(shí)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。從4組動(dòng)物中隨機(jī)選取20只,以任意采樣點(diǎn)的血漿藥物濃度數(shù)據(jù)(自變量)對(duì)CLobs(因變量)進(jìn)行逐步回歸分析以剔除無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量組合,考察CLobs與Ct1,Ct2,……Ctn的任意一點(diǎn)或多點(diǎn)的相關(guān)性(r2)。得到回歸方程:logCLobs=A0+A1×logCt1+A2×logCt2+…+An×logCtn,An為系數(shù)。將回歸方程按r2的大小依次列出,遴選出r2較好的回歸方程進(jìn)行模型驗(yàn)證。LSS模型的驗(yàn)證內(nèi)部驗(yàn)證采用Jack-knife法:每次從原樣本中(n=20)剔除1個(gè)樣本,得到樣本量為19的新樣本建立模型,然后對(duì)余下的l例進(jìn)行模型驗(yàn)證,得到預(yù)測(cè)值(CLest),以S-plus軟件實(shí)現(xiàn)。以平均預(yù)測(cè)誤差(meanpredictionerror,MPE,式1)評(píng)價(jià)回歸方程的準(zhǔn)確性,平均絕對(duì)誤差(meanabsolutepredictionerror,MAE,式2)評(píng)價(jià)模型的精密度,并計(jì)算其相應(yīng)的SD。MPE(%)越接近于0、MAE(%)越小、誤差的SD越小、參數(shù)預(yù)測(cè)誤差超過(guò)±15%的樣本數(shù)越少,則回歸方程的準(zhǔn)確性和精密度越好。篩選出最佳模型后進(jìn)行外部驗(yàn)證。MPE(%)=1n∑i=1n(CLest?CLΜΡE(%)=1n∑i=1n(CLest-CLobs)/CLobs×100%(1)MAE(%)=1n∑i=1n|CLest?CLΜAE(%)=1n∑i=1n|CLest-CLobs|/CLobs×100%(2)外部驗(yàn)證以經(jīng)同樣處理的另一群體樣本(n=20)的血藥濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)。以上述內(nèi)部驗(yàn)證準(zhǔn)確性較好的多元回歸方程計(jì)算其CLest。同法計(jì)算MPE(%),MAE(%)和SD,以評(píng)估模型外推后的準(zhǔn)確性和精密度。對(duì)參數(shù)的LSS估算值與DAS擬合值進(jìn)行Bland-Altman偏差分析,從而評(píng)價(jià)這兩種方法的計(jì)算結(jié)果是否具有一致性。結(jié)果1hplc方法1.1回歸方程的建立取大鼠空白血漿250μL,分別加入系列濃度MDZ標(biāo)準(zhǔn)工作液100μL,使得血漿藥物質(zhì)量濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.8、2、4、8和20mg·L-1,按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作。以樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(MDZ/IS)為橫坐標(biāo)X,MDZ濃度為縱坐標(biāo)Y,進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=1.9202X-0.007,r=0.9996。定量下限為0.1mg·L-1。1.2內(nèi)標(biāo)地西材料的測(cè)定在如上色譜條件下,血漿MDZ與內(nèi)標(biāo)地西泮分離良好,無(wú)干擾,二者的保留時(shí)間分別為8.3和10.2min。色譜圖見圖1。MDZ提取回收率在70%以上,日內(nèi)差、日間差均小于10%(表1)。內(nèi)標(biāo)地西泮的提取回收率為(80.68±2.77)%(n=5)。表明本文建立的方法準(zhǔn)確,重復(fù)性好。2ktc對(duì)mdz代謝及消除速率常數(shù)和清除率的影響溶劑對(duì)照組與不同劑量KTZ組血漿藥物濃度-時(shí)間曲線見圖2。各組Vd、T1/2β、K10、AUC0-∞等參數(shù)(表2)表明隨著KTZ劑量的增加,對(duì)MDZ體內(nèi)代謝的抑制作用逐漸增強(qiáng)。與對(duì)照組相比,MDZ半衰期明顯延長(zhǎng),而消除速率常數(shù)和清除率顯著減小(P<0.01)。其中,高劑量KTZ組T1/2β為對(duì)照組的170%,K10和CLobs分別為對(duì)照組的36%和40%。3lss法預(yù)測(cè)mtz分辨率3.1血藥濃度與st相關(guān)的相關(guān)性逐步回歸分析得到的有限采樣法數(shù)學(xué)模型和方程見表3。結(jié)果表明,雖然單點(diǎn)(90min)血藥濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)預(yù)測(cè)CLest的相關(guān)性尚可,但由兩點(diǎn)(60和90min)或三點(diǎn)(30、60和90min;30、60和120min)血藥濃度數(shù)據(jù)得到的估算值(CLest)與觀察值(CLobs)的相關(guān)性更為密切(r2>0.90)。進(jìn)一步增加采樣點(diǎn)僅使r2略增,誤差或精密度變化也不顯著。因此,采用這兩個(gè)或三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)建立LSS模型估算MDZ清除率。3.2模型驗(yàn)證3.2.1mdz清除率的計(jì)算Jack-knife法計(jì)算結(jié)果見表4。結(jié)果表明,分別由3組血藥濃度數(shù)據(jù)點(diǎn),即60和90min,30、60和90min,30、60和120min,建立的LSS模型均可對(duì)MDZ的清除率(CLobs)進(jìn)行較準(zhǔn)確的估算。3.2.2不同模型預(yù)測(cè)誤差小經(jīng)同樣處理的另一群體樣本進(jìn)行外部驗(yàn)證的結(jié)果(表5)進(jìn)一步表明,上述3個(gè)LSS模型預(yù)測(cè)誤差小,均可以準(zhǔn)確估算CLobs。兩種方法計(jì)算得到的清除率偏差分布的95%可信區(qū)間見圖3?？梢?采用兩點(diǎn)(60和90min)LSS模型預(yù)測(cè)肝臟CYP3A代謝活性最為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便。mdz活性的預(yù)測(cè)CYP是生物體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)代謝的主要酶系。以CYP為主的肝臟藥物代謝酶活性和/或含量受到多種因素的影響,肝臟本身的功能變化或某些食物或藥物成分的作用都可能干擾其代謝功能,關(guān)系到臨床用藥方案的制定和調(diào)整。選擇特異性CYP表型探針?biāo)幬飦?lái)評(píng)價(jià)重要的肝臟藥物代謝酶的活性可以為臨床制定個(gè)體化給藥方案提供依據(jù),鑒于50%～60%臨床常用藥物經(jīng)由CYP3A亞家族酶系代謝,故找到理想的反映CYP3A代謝能力的指標(biāo)成為研究的熱點(diǎn)。目前已明確的人類CYP3A包括CYP3A4、3A5、3A7、3A43等同工酶,其中最主要的是3A4和3A5,而雄性大鼠則以CYP3A2為主,二者對(duì)眾多底物生物轉(zhuǎn)化的特異性相近。大多數(shù)情況下藥物的體內(nèi)代謝研究反映的是CYP3A的總體活性。MDZ經(jīng)人CYP3A4和CYP3A5或成年雄性大鼠CYP3A2代謝轉(zhuǎn)化為1′-OH-MDZ、4-OH-MDZ和1,4-OH-MDZ。MDZ以其藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)和良好耐受性成為CYP3A體內(nèi)探針。而且,既可靜脈給藥也可口服,分別檢測(cè)肝臟和小腸的藥物代謝活性。不同的研究曾應(yīng)用不同藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)CYP3A活性,包括AUC0-∞,清除率,峰濃度和半衰期,血漿1′-OH-MDZ和MDZ的單點(diǎn)血藥濃度的比值(1′-OH-MDZ/MDZ)等,但都只限于對(duì)正常(健康)群體的研究。為了闡明由一開放群體得到的預(yù)測(cè)方程能否用于預(yù)測(cè)肝臟CYP3A代謝活性減低群體的MDZ清除率,本研究隨機(jī)選取以高、中、低劑量特異性CYP3A抑制劑KTZ或其空白溶液處理的大鼠作為研究對(duì)象并組成建模組(trainingset),依據(jù)Thummel等體外研究中證實(shí)的MDZ的CLs與肝CYP3A活性有線性關(guān)系,以LSS模型代替全程多點(diǎn)采樣,用CYP3A探針?biāo)庍溥_(dá)唑侖稀疏血藥濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)估算其清除率,建立CLest的預(yù)測(cè)模型,預(yù)測(cè)CYP3A代謝活性。數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后成正態(tài)分布,每個(gè)模型均顯示出良好的精密度。隨后,通過(guò)計(jì)算百分誤差進(jìn)行模型驗(yàn)證。以Jack-knife法進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證,篩選出最佳預(yù)測(cè)方程,并計(jì)算另一隨機(jī)群體中經(jīng)同樣處理的動(dòng)物的CLest,進(jìn)行外部驗(yàn)證。Bland-Altman偏差分析是比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的直觀方法,偏差分布的95%可信區(qū)間表明由這兩種方法計(jì)算得到的清除率具有較好的一致性。故3個(gè)LSS模型(60和90min;30、60和90min;30、60和120min)均可在肝臟代謝功能下降的情況下較好地估算大鼠體內(nèi)MDZ的清除率,進(jìn)而預(yù)測(cè)肝臟CYP3A的代謝活性。此方法誤差(MPE、MAE)小,其中60和90min兩點(diǎn)LSS預(yù)測(cè)模型則更為準(zhǔn)確且簡(jiǎn)便。本研究是針對(duì)肝臟藥物代謝酶CYP3A選取其特異性底物MDZ,通過(guò)對(duì)參數(shù)進(jìn)行分析,建立LSS模型,結(jié)果表明其最佳采樣點(diǎn)主要