中藥復(fù)方半夏和顆粒提取物抗五步蛇毒作用研究

中藥復(fù)方半夏和顆粒提取物抗五步蛇毒作用研究

半夏是天南星科的一種半夏植物。半夏具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效;臨床主要用于鎮(zhèn)咳、祛痰、鎮(zhèn)吐、抗?jié)?、抗心律失常等作用。滴水珠具有解毒消腫、散淤止痛功效;臨床用于治療頭痛、神經(jīng)痛、胃病等疾病。半夏、滴水珠對(duì)毒蛇咬傷也具有防治作用,但其抗蛇毒作用目前缺乏系統(tǒng)的研究。本研究對(duì)半夏和滴水珠生藥以及提取物的抗五步蛇毒中毒作用進(jìn)行了初步的考察,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1真空干燥箱及儀器(1)儀器。R201旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司),D180C自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海申勝生物技術(shù)有限公司),AR2130電子精密天平(OhausCorp.PineBrook,NJ,USA),DZG-6050型真空干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),SHZ-82恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司),YS-100普通顯微鏡(NIKON)。(2)試劑。無水乙醇(AR,杭州長征化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20110705),生理鹽水(浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):H10424-1),纖維蛋白原(FIB)(上海太陽生物技術(shù)有限公司,批號(hào):1320351),凝血酶時(shí)間(TT)測定試劑盒(凝固法)(上海太陽生物技術(shù)有限公司,批號(hào):121080),活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑盒(鞣花酸)(上海太陽生物技術(shù)有限公司,批號(hào):1121281),凝血酶原時(shí)間(PT)測定試劑盒(凝固法)(上海太陽生物技術(shù)有限公司,批號(hào):103181)。1.1.2動(dòng)物ICR小鼠72只,體重18～22g,雌雄各半,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.3蛇毒五步蛇為浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物技術(shù)研究所提供;五步蛇毒由本實(shí)驗(yàn)室采集,采用低溫冷凍干燥法進(jìn)行提取干燥,呈白色。1.1.4保證了辦學(xué)藥學(xué)博士丁志山博士的鑒定工作季德勝蛇藥片(南通精華制藥股份有限公司,批號(hào):110932),半夏和滴水珠(采自浙江省衢州市江山寶珠農(nóng)業(yè)有限公司,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)博士丁志山教授鑒定,質(zhì)量符合相關(guān)的規(guī)定)。藥物的提取:將半夏和滴水珠藥材分別打粉,過80目篩,分別取500g左右,加入2000ml95%乙醇回流提取1.5h,過濾,濾渣再次加入2000ml95%乙醇提取,共提取3次,合并3次濾液,減壓蒸餾將乙醇蒸干,得半夏和滴水珠醇提物,經(jīng)真空干燥24h后密封,陰暗條件下保存。乙醇提取物經(jīng)碘化鉍鉀顯色呈陽性,表明含生物堿類成分。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1給藥劑量及給藥方式將ICR小鼠隨機(jī)分為半夏醇提物組、滴水珠醇提物組、半夏生藥組、滴水珠生藥組、模型組(五步蛇毒損傷組)、空白對(duì)照組以及陽性對(duì)照組,其中模型組大鼠為12只,其余組均為10只。半夏醇提物組、滴水珠醇提物組分別給予半夏和滴水珠95%乙醇浸膏2mg/只(各藥物以生理鹽水為溶劑,配成混懸液),空白對(duì)照組和模型組用相同劑量的生理鹽水進(jìn)行給藥,陽性對(duì)照組給予季德勝蛇藥片30mg/只,生藥組給予對(duì)應(yīng)的生藥20mg/只(研缽中碾碎,用生理鹽水配成混懸液)。各組小鼠均以0.2ml的藥物灌胃,連續(xù)給藥7天,每日給藥1次。1.2.2大鼠中毒模型的建立各組小鼠均于末次給藥后1h(除空白對(duì)照組外),于腹腔注射五步蛇毒100μg/只,造成小鼠五步蛇毒中毒模型。1.2.3大鼠體重變化的測量各組小鼠每次給藥前以及處死前稱取體重,比較各組小鼠的體重變化情況。若注射五步蛇毒后導(dǎo)致小鼠死亡,則于小鼠死亡后立即稱取小鼠體重。1.2.4大鼠中毒的表現(xiàn)為造模后,由專人觀察并記錄各組小鼠的局部癥狀,以及食欲、呼吸、活動(dòng)等全身狀況,并在注射蛇毒12h后統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡率。1.2.5飲料的凝血酶活性測定小鼠造模后12h于眼眶取血1ml,加入0.1ml0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝管中,3000rpm×5min離心,取血漿,根據(jù)血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時(shí)間(TT)試劑盒說明書進(jìn)行操作,測定相關(guān)指標(biāo)。1.2.6紅細(xì)胞計(jì)數(shù)wbc(1)紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)。小鼠造模后于眼眶取全血10μl,立即用990μl紅細(xì)胞稀釋液(NaCl0.5g,檸檬酸鈉0.25g,甲醛溶液0.25ml,加蒸餾水溶解,定容到50ml)稀釋成紅細(xì)胞混懸液,取10μl,立即用490μl紅細(xì)胞稀釋液進(jìn)行稀釋后,在顯微鏡下用中方格計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2)白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)。小鼠造模后,于眼底靜脈叢取血10μl,用190μl白細(xì)胞稀釋液(冰醋酸加水稀釋成2%HAc溶液中,然后加入10g/L結(jié)晶紫3滴)稀釋,在顯微鏡下用大方格計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。(3)血小板(PLT)計(jì)數(shù)。小鼠造模后,于眼眶取全血10μl,立即用990μl血小板稀釋液[10g/L草酸銨稀釋液(乙二胺四乙酸二鈉0.006g,草酸銨0.5g,用50ml蒸餾水溶解,混勻)]稀釋成混懸液,取500μl,再用500μl血小板稀釋液稀釋后,于顯微鏡下用大方格計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。1.2.7肝胰腺、肝臟和脾指數(shù)測定小鼠末次給藥20min后注射五步蛇毒,注五步蛇毒12h后處死小鼠,摘出胸腺、肝臟和脾臟稱重,計(jì)算胸腺、肝臟和脾指數(shù)。計(jì)算公式:肝指數(shù)=肝臟重量/小鼠體重×100%;胸腺指數(shù)=胸腺重量/小鼠體重×100%;脾臟指數(shù)=脾臟重量/小鼠體重×100%。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,行雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。組間多重?cái)?shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠體重和體重的變化各組小鼠灌胃給藥7天后,統(tǒng)計(jì)每天體重。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在灌胃給藥4天時(shí)各組小鼠體重都有一定幅度的增加,但各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在給藥第5天開始,半夏生藥組和滴水珠生藥組的小鼠體重明顯下降,與其他組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);半夏醇提物組及滴水珠醇提物組的小鼠體重與空白對(duì)照組和模型組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖1。2.2小鼠急性毒性反應(yīng)的比較模型組部分小鼠在注射五步蛇毒10min后出現(xiàn)抽搐,活動(dòng)減少;30min后模型組3只小鼠死亡,且除空白對(duì)照組外,其余組的小鼠也出現(xiàn)行動(dòng)遲緩的現(xiàn)象,繼而出現(xiàn)不飲水,呈嗜睡、呼吸急促等中毒癥狀,但半夏、滴水珠生藥及醇提物組的小鼠在一定程度上可緩解中毒癥狀。2.3小鼠死亡率測定見表1。造模6h后,除空白對(duì)照組外,其余組小鼠均出現(xiàn)死亡。各組小鼠五步蛇毒造模中毒后12h,模型組12只小鼠中4只死亡,死亡率為33.33%;其余各組小鼠的死亡率與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);醇提物組的小鼠死亡率低于生藥組,半夏的死亡率低于滴水珠,半夏醇提物與陽性對(duì)照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明半夏的抗蛇毒作用優(yōu)于滴水珠。2.4兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)比較見表2。半夏生藥組和滴水珠生藥組可引起小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)下降,但兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組各與其他組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。比較各組小鼠的肝臟指數(shù),除陽性對(duì)照組外,各組小鼠于注射五步蛇毒后均顯著影響肝臟指數(shù),與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2.5各組小鼠小板計(jì)數(shù)的比較見表3。從表3可見,五步蛇毒造模后小鼠的紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù)明顯減少,與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各藥物組與模型組的小鼠比較,P<0.05;與陽性對(duì)照組比較,P<0.05。各生藥組與提醇物組比較,P<0.05。2.6對(duì)凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血酶時(shí)間和活見表4。從表4可見,五步蛇毒造模后小鼠血漿纖維蛋白原(FIB)含量上升,凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)延長,與空白對(duì)照組相比,P<0.05;與各藥物組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與陽性對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各生藥組與醇提物組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3對(duì)樣品含量和測定的影響在民間,半夏和滴水珠常用于五步蛇咬傷的治療,常見的治法即直接吞服滴水珠或半夏生藥,再配合一些清熱解毒藥物如紫花地丁等外敷。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),半夏和滴水珠生藥對(duì)五步蛇毒中毒小鼠具有一定的療效,與蛇毒損傷模型組相比,半夏和滴水珠能顯著影響五步蛇中毒小鼠血液中PT、TT、APTT和FIB,同時(shí),對(duì)五步蛇毒中毒小鼠血液中血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)也有一定的影響,與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但效果不如季德勝蛇藥的陽性對(duì)照組。此外,半夏和滴水珠生藥雖然有一定的療效,但可影響小鼠的正常生長(體重比空白對(duì)照組和醇提物組輕),故在使用時(shí)必須嚴(yán)格注意用量,并加強(qiáng)監(jiān)管。但通過乙醇提取可有效降低半夏和滴水珠的毒性,與生藥組相比脾臟指數(shù)、體重變化率等均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且可提高療效(與生藥組相比有顯著性差異)。有文獻(xiàn)報(bào)道,被五步蛇咬傷,局部傷口(牙痕)處立即注射50%～75%的酒精可收到一定的解毒效果。本研究結(jié)果顯示,乙醇提取可以提高中藥半夏和滴水珠的抗五步蛇毒中毒作用。季德勝蛇藥片是目前常用的治療毒蛇咬傷的中成藥。我們觀察發(fā)現(xiàn),季德勝蛇藥抗蛇毒的效果優(yōu)于半夏、滴水珠等單味藥,且未出現(xiàn)毒副作用,但季德勝蛇