動(dòng)物線粒體全序列測(cè)定的研究進(jìn)展

動(dòng)物線粒體全序列測(cè)定的研究進(jìn)展

線條是真核細(xì)胞中的一個(gè)非常重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞氧化和磷酸的場(chǎng)所。動(dòng)物線粒體基因組具有相對(duì)較小(約為15~19kb)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳和進(jìn)化速率快等特點(diǎn)。在分子生物學(xué)研究方面,其不僅是研究DNA結(jié)構(gòu)與復(fù)制轉(zhuǎn)錄的良好模型,也是研究真核細(xì)胞核酸與蛋白質(zhì)合成的模型系統(tǒng)。此外,線粒體基因組作為一種分子標(biāo)記,廣泛應(yīng)用于動(dòng)物界不同等級(jí)階元系統(tǒng)發(fā)育的研究。自1981年4月9日,英國(guó)《Nature》雜志公布人類線粒體基因組全序列以來(lái),至2008年3月,在不足30年的時(shí)間內(nèi),NCBI中共收錄了后生動(dòng)物的線粒體基因組全序列1195條,其中,六足動(dòng)物線粒體基因組全序列81條,研究范圍涉及六足總綱的18個(gè)目。動(dòng)物線粒體基因組全序列的研究方法,通過(guò)逐漸改進(jìn)趨于成熟,本文對(duì)其發(fā)展進(jìn)行了綜述。1檢測(cè)差分化的mtcda在PCR技術(shù)引入線粒體DNA(簡(jiǎn)稱mtDNA)分離以前,對(duì)于線粒體基因組全序列的測(cè)定,主要包括以下2部分內(nèi)容:(1)高純度mtDNA的獲得;(2)mtDNA片段化成適于克隆測(cè)序的短DNA片段。1.1梯度離心法和差速離心法高純度mtDNA的獲得,主要有密度梯度離心法和差速離心法。此外,還有在此基礎(chǔ)上進(jìn)行局部?jī)?yōu)化的方法,如DNase法、堿變性法和改良的堿變性法等。1.1.1分離學(xué)生的氯化氯化銫密度梯度離心,不事先制備密度梯度,而是制備6mol/L氯化銫溶液,待分離的大分子溶解在氯化銫中時(shí),置于高離心場(chǎng)中,氯化銫開(kāi)始沉降;經(jīng)過(guò)幾小時(shí)后達(dá)到平衡,形成穩(wěn)定的氯化銫密度梯度,大分子混合物按照顆粒的密度分布,在各區(qū)帶中被分開(kāi)。此法可獲得極高分辨力,特別適用于分離不同類型的核酸。1.1.2mtcda的獲得差速離心法,又稱為分級(jí)離心法,由Tamura和Aotsuka最早建立,由于組織勻漿后的混合液中,不同組分的質(zhì)量不同,利用在離心力場(chǎng)下沉淀它們的離心力不同的原理將組分分離。為了獲得特定的組分,通常需要進(jìn)行一系列的離心。首先選擇較低的離心速度和較短的離心時(shí)間,將不需要的大粒子沉淀去除后,再選擇較高的離心速度和較長(zhǎng)的離心時(shí)間,將所需的組分沉淀下來(lái),而大多數(shù)更小的粒子則留在上清液中。去除上清液后,再以相同的介質(zhì)將沉淀懸浮后,重復(fù)上述的差速離心,如此反復(fù)多次,直到獲得純度較高的特定組分。獲得純度較低的線粒體后,再通過(guò)DNase消化附著在線粒體表面的核DNA,堿變性,高濃度鹽溶液復(fù)性,最終獲得高純度的mtDNA。如魯成等利用差速離心法獲得線粒體后,在DNase法和堿變性法基礎(chǔ)上建立的改良后的堿裂解法對(duì)家蠶mtDNA進(jìn)行提取。Saito等利用差速離心法對(duì)果蠅屬Drosophila4種果蠅、紅粉甲蟲Triboliumcastaneum、飛蝗Locustamigratoria和家蠶Bombyxmori的線粒體DNA進(jìn)行了分離。1.2線條dna段化上述方法獲得mtDNA通常通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化或超聲波隨機(jī)打斷的方法,片段化為適合克隆測(cè)序的短DNA片段。1.2.1mtnda基因回復(fù)突變體acci選用切割位點(diǎn)較少且分布較均勻的1種或幾種限制性內(nèi)切酶對(duì)mtDNA進(jìn)行完全或不完全消化,形成長(zhǎng)度約為數(shù)百堿基不等的短DNA片段,利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳將各種長(zhǎng)度的DNA片段充分分離,并最終將其克隆至質(zhì)粒載體中進(jìn)行測(cè)序。如Crozier和Crozier利用限制性內(nèi)切酶EcoRI,BclI和BglII對(duì)蜜蜂Apismellijeru線粒體DNA進(jìn)行切割后克隆至pUC8或pUC18。此外,使用AccI對(duì)mtDNA進(jìn)行切割,使用DNA聚合酶I對(duì)Klenow片段末端進(jìn)行修飾后,經(jīng)BclI或EcoRI切割后克隆至pUC18。除最小的AccI片段(527bp)外,克隆片段幾乎覆蓋了蜜蜂mtDNA的所有區(qū)域。pUC克隆被亞克隆至M13mp8,M13mp18和M13mp19后進(jìn)行序列測(cè)定。1.2.2克隆及測(cè)序獲得的mtDNA,利用不同強(qiáng)度的超聲波隨機(jī)打斷,形成短DNA片段后,克隆至質(zhì)粒載體中進(jìn)行測(cè)序。如魯成等將差速離心法獲得的家蠶mtDNA,經(jīng)超聲波隨機(jī)打斷后,回收長(zhǎng)度為1.5~3.0kb的DNA片段,并克隆于pUC18載體,挑取300個(gè)克隆進(jìn)行重組質(zhì)粒測(cè)序。2引物篩選及其擴(kuò)增參考公布的線粒體基因組研究通用引物,或通過(guò)近源物種的線粒體基因組全序列,設(shè)計(jì)出能覆蓋全基因組的引物,采用常規(guī)PCR技術(shù)直接由總DNA中對(duì)線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增,形成一系列長(zhǎng)度短于5kb的DNA片段,并將其克隆進(jìn)質(zhì)粒載體進(jìn)行測(cè)序。如Friedrich和Muqim利用7對(duì)引物將鞘翅目紅粉甲蟲T.castaneum線粒體基因組擴(kuò)增為長(zhǎng)度介于1.1~3kb的DNA片段,利用EcoRI單獨(dú)消化或EcoRI和ClaI雙消化后,克隆至ClaI或EcoRI進(jìn)行測(cè)序。Lee等利用8對(duì)引物對(duì)鱗翅目茶小卷蛾Adoxophyeshonmai線粒體基因組進(jìn)行了擴(kuò)增,并將其克隆至pGEM-TEasy載體,利用1對(duì)質(zhì)粒通用引物和內(nèi)部步移引物進(jìn)行測(cè)序。張穎等利用17對(duì)引物對(duì)緬甸陸龜Indotestudoelongate線粒體基因組進(jìn)行了擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1.0~1.2kb左右。施燕峰等通過(guò)近源物種的比較,設(shè)計(jì)出20對(duì)引物對(duì)赤麂Muntiacusmuntjak線粒體基因組進(jìn)行了擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物均小于1.2kb。多數(shù)常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度可直接克隆至質(zhì)粒載體進(jìn)行測(cè)序,亦可通過(guò)相同的引物進(jìn)行PCR法直接測(cè)序。3國(guó)內(nèi)染色體基因組分離和擴(kuò)增L-PCR通常是指擴(kuò)增5kb以上的DNA片段,對(duì)模板、引物和聚合酶都有相對(duì)較為嚴(yán)格的要求。近年來(lái),盡管通過(guò)L-PCR技術(shù)一步擴(kuò)增整個(gè)線粒體基因組已有報(bào)道,但是將線粒體基因組擴(kuò)增為2個(gè)或幾個(gè)相互重疊的DNA大片段則更多地為廣大研究人員所采用,成為一種理想的線粒體基因組分離策略。Kim等利用通用引物對(duì)直翅目東方螻蛄Gryllotalpaorientalis線粒體基因組的cox1進(jìn)行擴(kuò)增和序列測(cè)定,并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出1對(duì)L-PCR引物,對(duì)線粒體基因組的剩余部分(約15kb)進(jìn)行擴(kuò)增。劉念等利用NCBI中已有的昆蟲線粒體基因組序列,通過(guò)比對(duì)設(shè)計(jì)出2對(duì)通用L-PCR引物(LP03/LP04由cox1→Cytb擴(kuò)增長(zhǎng)度約9kb;引物L(fēng)PCytb/LPCOII由Cytb→cox2擴(kuò)增長(zhǎng)度約8kb),將10種蝗總科昆蟲的線粒體基因組擴(kuò)增為2個(gè)相互重疊的DNA片段。L-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離純化后,既可以作為常規(guī)PCR二次擴(kuò)增的模板,利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增成短DNA片段后進(jìn)行測(cè)序,也可以作為引物步移法測(cè)序的模板進(jìn)行