牛卵母細胞的玻璃化凍融與體外受精

牛卵母細胞的玻璃化凍融與體外受精

目前，動物育種、果基因庫的建立和發(fā)展非常迅速，但所需的大量卵母細胞來自屠夫場收集的卵母細胞。這就必然受季節(jié)變化導致卵母細胞質量改變和屠宰時間的限制,所以大大阻礙了研究工作的開展。而卵母細胞冷凍保存技術,可以為胚胎的體外生產(chǎn)及相關生物技術的研究提供充足的材料來源;同時也是保存品種資源的一種經(jīng)濟有效的手段。研究者借鑒傳統(tǒng)胚胎冷凍方法,首先在小鼠和倉鼠卵母細胞冷凍保存中獲得成功。十年后,利用同樣方法冷凍人卵母細胞,受孕者妊娠并產(chǎn)下嬰兒。但結果都表明卵母細胞冷凍保存效果遠不及胚胎。家畜卵母細胞冷凍保存研究進展較慢,冷凍后卵母細胞的受精率、卵裂率和囊胚率都較未冷凍卵母細胞低,迄今只在兔和牛獲得來自冷凍成熟卵母細胞的少數(shù)幾個后代。近年研究表明,玻璃化冷凍方法可以避免在細胞內(nèi)形成冰晶,降低低溫對細胞產(chǎn)生的損傷,更適于卵母細胞冷凍保存。而牛卵母細胞對低溫尤其敏感,發(fā)育到囊胚的比例僅為0%～10%,而且試驗結果的重復性較差。因此,我們有必要深入探討影響玻璃化冷凍保存卵母細胞的因素,為進一步提高牛卵母細胞冷凍保存效果提供理論基礎和技術途徑。1材料和方法1.1透明質酸酶去除卵丘細胞后的冷凍保存牛卵丘卵母細胞復合體(COCs)成熟培養(yǎng)參考Fuku等。將培養(yǎng)成熟的COCs用0.1%的透明質酸酶去除部分卵丘細胞后進行冷凍保存。試驗中將卵母細胞體外分別培養(yǎng)0、4、8和15h后冷凍保存,解凍后移入成熟培養(yǎng)液中,分別繼續(xù)培養(yǎng)22、18、14和7h(總培養(yǎng)時間約為22h)再進行體外受精。1.2母細胞的冷凍和解凍1.2.1u3000添加0.8mso和0.2的母液將四孔板(Co.Nunc)置于恒溫臺上,分別放置母液(含20%FCS、0.025mM/mLHepes和0.00596g/mL肝素的M199液)、VS1(含10%DMSO和10%EG的母液)和VS2(含20%DMSO、20%EG和0.3M蔗糖的母液)各0.8mL。將欲冷凍的卵母細胞先放在母液中,然后取2～4枚卵母細胞放在VS1中平衡一段時間,接著將卵母細胞連同盡量少的VS1放入VS2中,再將之連同1～2μL的VS2放入空白孔中,用毛細玻璃管(內(nèi)徑為0.8mm、長為10cm的高硼硅玻璃管)將卵母細胞吸入,立即投入液氮(從卵母細胞放入VS2到裝管投入液氮整個過程在25s內(nèi)完成)。1.2.2解剖和組織學檢測在四孔板置于恒溫臺上,分別放置VS1、解凍液1(含0.3M蔗糖和20%FCS的M199液)、解凍液2(含0.15M蔗糖和20%FCS的M199液)和保持液(含20%FCS的M199液)各0.8mL。將毛細玻璃管從液氮中取出,在空氣中停留3～4s,含液體的一端插入VS1中,在顯微鏡下觀察到細管后用手指堵住細管的另一端,讓卵母細胞流入四孔板中,確認數(shù)目后立即移入解凍液1中停留1min,然后移入解凍液2中停留5min,再移入保持液中停留5min,進行形態(tài)學評定。以解凍后卵丘細胞未脫落、透明帶完整、胞質均勻的卵母細胞判為形態(tài)正常。選取形態(tài)正常卵進行體外受精。1.3精子濃度的確定15mL離心管內(nèi)先加入1～2mL受精A液(含10mM咖啡因的BO液),然后取冷凍精液(試驗所用精液來自同一頭經(jīng)過IVF測試的荷斯坦公牛)兩管(Co.GRI)投入39℃燒杯內(nèi)水浴解凍,至冰晶消失后用干酒精棉擦干管壁水珠,待酒精揮發(fā)后用剪刀剪掉冷凍管兩端,將精液倒入離心管內(nèi),再添加A液至10mL左右。400r/min離心5min,快速移去上清,再離心一次并去掉上清。緩慢加入0.5mLA液與B液(含20mg/mLBSA和20μg/mL肝素的BO液)等體積的混合液,離心管呈30～40度角傾斜放置在39℃,5%CO2,100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)30min,待精子上游后取頂端液體進行精子記數(shù)并調整精子密度為106/mL,然后制作50μL精液小滴,上覆石蠟油。將成熟卵母細胞在受精混合液中洗三遍,然后放入精液滴中,每滴約15～20枚卵,在39℃,5%CO2,100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)6h后將卵母細胞在mSOFaa液中洗三遍,然后放入20μLmSOFaa液滴中,每滴約10枚卵左右,隔天換半液,繼續(xù)培養(yǎng)7～9d,在倒置顯微鏡下觀察并記錄發(fā)育到2-細胞、4-細胞、8-細胞和囊胚的數(shù)目。1.4an對s統(tǒng)計分析每組試驗都重復3次以上。實驗數(shù)據(jù)利用SPSS統(tǒng)計軟件(SPSSInc.)的ANOVA模塊分析。數(shù)據(jù)先經(jīng)LSD轉換后進行單因素方差分析,P<0.05為差異顯著。2結果2.1冷凍解凍法為研究冷凍前平衡時間對牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍保存的影響,我們將部分脫卵丘細胞成熟卵在VS1液中分別平衡0min、1min、3min、5min和10min,然后移入VS2液中裝管冷凍,解凍時先移入VS1液中停留15s,對照組為未經(jīng)冷凍的成熟卵母細胞。結果(表1)表明,平衡1min和3min組冷凍解凍后卵母細胞的形態(tài)正常率、2-細胞、4-細胞、8-細胞和囊胚發(fā)育率都較其他各組高(P<0.05),但都顯著低于對照組(P<0.05);而且隨著平衡時間(5min和10min)的延長,形態(tài)正常率和胚胎發(fā)育水平都逐漸降低。2.2抗凍保護劑對卵母細胞的影響a、b、c、d同一列數(shù)據(jù)中含相同字母者差異不顯著(P>0.05),以下同為研究解凍時VS1液處理對牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍的影響,我們將部分脫卵丘細胞成熟卵在VS1液中平衡1min后冷凍保存,解凍時分別在VS1液中處理0s、15s、30s和60s,然后依次移入蔗糖解凍液中脫除抗凍保護劑,對照組為未經(jīng)冷凍的成熟卵母細胞。結果(表2)表明,VS1液中處理15s組卵母細胞的形態(tài)正常率、2-細胞、4-細胞和8-細胞率與未處理組(0s)差異不顯著(P>0.05),但囊胚發(fā)育率較未處理組顯著提高(P<0.05),分別為11.8±2.5%和4.9±0.7%;隨著VS1液處理時間(30s和60s)的延長,形態(tài)正常率、2-細胞、4-細胞、8-細胞和囊胚發(fā)育率逐漸降低。2.3不同培養(yǎng)條件對卵丘卵母細胞的影響為確定冷凍時卵丘細胞對牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍保存的影響,我們將未脫卵丘卵、部分脫卵丘卵和裸卵分別在VS1液中平衡1min后冷凍保存,解凍時在VS1液中處理15s,對照組為未經(jīng)冷凍的成熟卵母細胞。結果(表3)表明,部分脫卵丘組卵母細胞的形態(tài)正常率、2-細胞、4-細胞、8-細胞和囊胚發(fā)育率顯著高于未脫卵丘組和裸卵組(P<0.05)。2.4解凍卵母細胞為研究牛卵母細胞所處減數(shù)分裂階段對玻璃化冷凍保存的影響,我們將卵母細胞在體外分別培養(yǎng)0、4、8、15和22h(其中15、22h組卵母細胞進行部分脫卵丘處理),然后在VS1液中平衡1min后冷凍保存,解凍時在VS1液中處理15s,對照組為未經(jīng)冷凍的成熟卵母細胞。結果(表4)表明,卵母細胞體外培養(yǎng)15h以內(nèi),解凍后形態(tài)正常率與成熟22h組無顯著差別(P>0.05);但2-細胞、4-細胞、8-細胞和囊胚發(fā)育率顯著低于成熟22h組(P<0.05)。3討論3.1冷凍和解凍卵母細胞的方法價值由于牛卵母細胞對低溫特別敏感,實驗表明,在25℃～4℃環(huán)境下停留1min即造成MⅡ期紡錘體去極化。而玻璃化冷凍法通過將卵母細胞懸浮于體積很小的液滴(1～2μL)中從而極大的提高降溫速率,使卵母細胞越過“低溫敏感區(qū)”,從而將冷凍造成超微結構的損傷降到最低程度。而且,由于液滴的體積非常小,冷凍或解凍時不致因為內(nèi)外熱傳導不平衡造成透明帶碎裂和質膜溶解。本試驗中我們考慮到毛細玻璃管壁薄,導熱性強,降溫和復溫速率快,因此采用毛細玻璃管作為冷凍保存卵母細胞的載體,解凍后形態(tài)正常率在90%以上,顯然對卵母細胞的表觀結構并未造成明顯的破壞;囊胚發(fā)育率在10%左右,較前人研究沒有明顯提高。我們認為可能與卵母細胞的來源有關,試驗中卵母細胞大部分取自屠宰場中性成熟前小母牛(<1.5歲)。已有報道表明,性成熟前小母牛卵母細胞的囊胚發(fā)育率顯著低于成年牛。這從試驗的對照組中也可看出,囊胚率(20%左右)明顯低于其他報道中的比率(35%～50%)。3.2不同介質對樹母細胞的催化作用許多報道中提出,玻璃化冷凍法存在的問題是玻璃化冷凍液不可避免地會對卵母細胞造成化學毒性損傷和滲透壓損傷。因此,為縮短卵母細胞與玻璃化溶液接觸時間,將其從生理溶液中直接移入玻璃化溶液中,然后立即投入液氮保存。但有報道認為這種處理方法造成解凍后卵母細胞形態(tài)正常率和胚胎發(fā)育率都較低。我們試驗中結果也表明,直接將卵母細胞移入玻璃化溶液中冷凍保存,解凍后形態(tài)正常率明顯降低,且無一例胚胎發(fā)育到囊胚?？赡艿脑蚴遣ＡЩ芤禾幚頃r間短,未能充分滲透到細胞內(nèi)部,造成細胞內(nèi)冰晶的形成,從而損傷細胞的超微結構。鑒于此目前大多數(shù)研究者采用分步平衡法處理卵母細胞,即先在含低濃度抗凍保護劑的溶液中平衡而不會導致毒性損傷,然后再移入玻璃化溶液中冷凍保存。我們試驗中發(fā)現(xiàn),卵母細胞在10%DMSO+10%EG液中平衡1～3min,冷凍效果明顯提高,但隨著處理時間的延長,冷凍效果逐漸降低。朱士恩等報道牛成熟卵母細胞在10%DMSO+10%EG液中平衡25～30s然后玻璃化冷凍,即能獲得高比例的囊胚發(fā)育率。其他一些報道中也有采用處理5～10min不等的,這可能與選用的抗凍保護劑種類與濃度不同有關。3.3不同濃度蔗糖對卵母細胞的影響卵母細胞解凍時,即利用蔗糖的滲透壓作用脫出細胞內(nèi)部的抗凍保護劑,解除其對卵母細胞的毒性作用。然而,我們在試驗中發(fā)現(xiàn),解凍時將卵母細胞先移入10%DMSO+10%EG液中處理15s,然后依次移入不同濃度的蔗糖稀釋液中,卵母細胞的形態(tài)正常率、2-細胞、4-細胞和8-細胞率與未處理組無差別,但囊胚發(fā)育率較未處理組顯著提高,而且其結果的重復性強,這可能與緩解過度的滲透壓刺激有關。3.4抗凍保護劑的使用與卵丘細胞的生迄今為止,卵丘細胞對成熟卵母細胞冷凍保存的影響并沒有系統(tǒng)研究,絕大部分文獻只在材料與方法中提到采用部分脫卵丘細胞的方法處理卵母細胞,即以卵母細胞周圍留有2～3層卵丘細胞為宜。僅有一篇報道表明,部分脫卵丘細胞卵和裸卵對冷凍保存的牛卵母細胞孤雌激活后卵裂率和囊胚率無明顯影響。說明帶有部分卵丘細胞的卵母細胞玻璃化冷凍保存時,抗凍保護劑能充分滲透到細胞內(nèi),不會造成冰晶的形成?？紤]到卵母細胞冷凍保存后主要用途之一是進行體外受精,而研究表明,卵丘細胞對成熟卵母細胞體外受精有重要作用。因此,卵母細胞冷凍時應保留全部或部分卵丘細胞。我們在試驗中發(fā)現(xiàn),對卵丘細胞不做處理,解凍后卵母細胞的形態(tài)正常率顯著低于部分脫卵丘細胞卵?？赡艿脑蚴锹涯讣毎l(fā)育成熟后,卵丘細胞與卵母細胞的縫隙連接數(shù)量急劇下降,并且因粘液化和卵丘細胞擴張,卵母細胞和周圍的卵丘細胞不再偶聯(lián),這時尤其是外圍的卵丘細胞很容易散開并脫離卵母細胞,這樣造成卵丘細胞層數(shù)不一致,冷凍時不能很好地控制平衡時間,致使卵母細胞受到損傷。而部分脫卵丘細胞卵因外圍卵丘細胞層數(shù)基本一致,便于進行統(tǒng)一操作處理,冷凍效果較卵丘細胞不做處理組好。3.5冷凍保存時間對牛卵母細胞的影響已有研究表明,卵母細胞減數(shù)分裂階段影響卵母細胞低溫保存后的成活及后期發(fā)育。GV期卵母細胞較MⅡ期卵母細胞更難冷凍保存,經(jīng)冷凍保存后會引起一系列的問題,如皮質顆粒外排、紡錘體受損、染色體分散進而導致受精率降低。Hochi等報道將牛卵母細胞體外分別培養(yǎng)0、6、12和24h后冷凍保存,發(fā)現(xiàn)卵母細胞培養(yǎng)12h