新月葉片組織培養(yǎng)的影響因素

新月葉片組織培養(yǎng)的影響因素

月月也是著名的春、瘦客、春花、四季紅和月月紅。它來自中國，是薔薇科和薔薇科的植物。月季為半常綠灌木,花朵俏麗,色彩豐富,被譽為“花中皇后”。月季花能吸收硫化氫、氟化氫、苯、苯酚等有害氣體,同時對二氧化硫、二氧化氮等有較強的抵抗能力,因此月季花是保護(hù)和美化人類生活環(huán)境的良好花木。目前我國月季有上千個品種,但由于其繁殖以扦插繁殖為主,繁殖速度慢,滿足不了生產(chǎn)發(fā)展的需要,而組織培養(yǎng)可在短期內(nèi)獲得大量的優(yōu)良種苗,為此,我們撰寫了這篇文章,期望能夠促進(jìn)月季組培快繁的研究工作。影響月季葉片組織培養(yǎng)成功與否的因素很多,現(xiàn)總結(jié)如下。1材料因素的影響1.1選擇物種依據(jù)對愈傷組織的誘導(dǎo)大量試驗證實,組織培養(yǎng)中基因型的依賴性是一種普遍現(xiàn)象。由于基因型的影響,不同月季品種間的組織再生頻率不同。任桂芳、王建紅、馮慧等選取24個現(xiàn)代月季品種無菌苗的頂生3片葉接種于培養(yǎng)基上,15d時部分品種葉片葉柄砧處開始不規(guī)則膨大,20d時可見綠色芽點,40d后形成不定芽,50d時12個品種可見不定芽的分化,且不同品種間的分化率差異很大,為10.9%～46.5%,其余12個品種未見不定芽分化。冰山品種的再生頻率最高,為46.5%。林婭、鄭玉梅等研究發(fā)現(xiàn),月季不同品種之間愈傷組織誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)數(shù)量差異顯著?！八_曼莎”、“金斯萊克”、“休姆主教”、“寵愛小姐”、“藍(lán)絲帶”、“卓越”、“埃菲爾鐵塔”7個品種在適宜的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率都能夠達(dá)到100%;而“櫻桃白蘭地”和“綠野”的愈傷組織誘導(dǎo)率分別只有60%和50%。此外,愈傷組織誘導(dǎo)的數(shù)量也因品種不同而有很大差異,依次是“薩曼莎”、“休姆主教”、“埃菲爾鐵塔”愈傷組織直徑為3～4mm,“卓越”2～3mm,“金斯萊克”、“寵愛小姐”、“藍(lán)絲帶”1～2mm,“櫻桃白蘭地”、“綠野”4～7個愈傷粒,愈傷粒直徑1～2mm。Hsia等報道不同品種、不同外植體在不同NAA濃度上產(chǎn)生不同的效果,‘BabyKatie’的葉片愈傷組織在11,27μmol/LNAA濃度下愈傷組織發(fā)生率高,并有根形成,在54,81μmo1/L有3%再生率?！癛edSunblaze”葉片愈傷組織在11μmo1/L可達(dá)到6.6%的再生率。1.2影響生理狀態(tài)的影響1.2.1培養(yǎng)材料的選擇Chritel等以蘋果葉片為試材的比較試驗發(fā)現(xiàn),不同來源的蘋果葉片其再生能力從大到小的順序為:試管苗、溫室苗、根蘗苗。月季上,朱鹿鳴等對50多個名貴月季品種進(jìn)行了試管繁殖試驗。在幾種基本培養(yǎng)基(MS、Wpm、B5等)上均可成功。但以MS較好。不同品種月季在同一分化培養(yǎng)基上,其繁殖系數(shù)有較大差異。用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)月季小芽其增殖速度比固體快,且小苗生長粗壯,但其培養(yǎng)方法有待進(jìn)一步完善。誘導(dǎo)根原基的培養(yǎng)基為MS+NAA0.5mg/L或MS+IBA1.0mg/L。具有根原基的試管苗移栽成活率高,移栽速度快,可脫離培養(yǎng)基遠(yuǎn)距離運輸,故用具有根原基試管苗比用根系已長出的試管苗有較大的優(yōu)越性。1.2.2愈傷組織的觀察高莉萍、包滿珠用小葉和復(fù)葉柄作外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)8d后,切口處不同程度地膨大,以小葉外植體膨大更為明顯,未見明顯的愈傷組織。小葉中幼嫩、體積大并具有較長小葉柄者,小葉柄基部膨大程度最高,肉眼可見白色突起,是已分化的不定芽。切口膨大并已形成白色突起的外植體轉(zhuǎn)入發(fā)枝培養(yǎng)基進(jìn)行光下培養(yǎng)后,突起很快變綠,抽出葉片并發(fā)育成枝條小葉外植體和復(fù)葉柄外植體的再生存在顯著性差異,2次重復(fù)試驗共60片小葉和40個復(fù)葉柄,其中51.8%的小葉和10%的復(fù)葉柄再生不定芽,平均每個外植體分化1.3和1個不定芽。1.2.3葉片外植體再生任桂芳、王建紅、馮慧等將金秀娃、冰山和火球3個月季品種無菌苗的不同部位葉片(頂生3片葉、中部葉片和基部葉片)接種于培養(yǎng)基上。結(jié)果表明頂部葉片的分化率最高,中部葉片次之,下部老葉片未見分化。高莉萍、包滿珠做了2次重復(fù)共試驗了49個三位葉和46個五位葉,平均有30.7%的三位葉和53.9%五位葉再生不定芽,每小葉再生1～2個不定芽。雖然五位葉的再生率高于三位葉,但它們之間并沒有顯著性差異。而且他們發(fā)現(xiàn)葉位對再生的影響不大,只要是幼嫩的未展開的小葉都能有效再生植株。因此,采用小葉外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時,材料的選取不必受到葉片位置的限制,材料來源更加豐富。Dubois等報道的兩步直接再生不定芽的方法是目前所報道再生率最高,需時最短的再生方法。他們首先將采自田間未展開的幼嫩復(fù)葉消毒后切成帶柄的小葉,此小葉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2MS+1.5mg/LTDZ(噻重氮苯基脲)+0.05mg/LNAA+100mg/LCH(水解酪蛋白)+10mg/LAgNO3)上黑暗下誘導(dǎo)8天,然后.轉(zhuǎn)入發(fā)枝培養(yǎng)基(MS+0.5mg/LBA+0.01mg/LNAA+0.1mg/LGA3)中不定芽長成植株。所試24個品種25天后不定芽的再生率為65%～100%(其中15個品種再生效果非常好,5種較好,4種中等)。再生率越高的品種,再生所需時間越短,不定芽生長越快,且再生芽數(shù)也越多,并且田間苗較組培苗的效果好。張常青、洪波、王海琴等在葉柄再生芽的誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn),經(jīng)一定黑暗條件的誘導(dǎo)培養(yǎng)和光周期再生培養(yǎng),不定芽再生可以同時通過愈傷組織發(fā)生和器官直接發(fā)生得到。葉柄外植體在添加7μmol/LTDZ的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)10d,再轉(zhuǎn)接到MS添加0.5mol/L6-BA的再生培養(yǎng)基中16h/8h光周期培養(yǎng),可以獲得57.1%的芽再生率。2-ba和naa、2,4-d的ms培養(yǎng)基的使用效果劉軍、豐震、趙蘭勇等研究發(fā)現(xiàn),添加了生長素2,4-D的培養(yǎng)基比只有6-BA和NAA兩種激素的組合的其葉片愈傷組織誘導(dǎo)率要高,并且愈傷組織也比后者的大。2,4-D與細(xì)胞分裂素6-BA共同作用的效果明顯好于單獨使用的效果。對于品種來說,金徽章的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于婚禮白。Rout等以Landora材料,在添加6-BA和NAA,2,4-D的MS培養(yǎng)基上,外植體葉在接種的7～12d后,在近軸面的葉柄和中脈處產(chǎn)生愈傷,愈傷組織誘導(dǎo)頻率高達(dá)92%。Hsia和Korban及Li等將品種R.hybrida‘CarefreeBeauty’的葉和節(jié)間在含2,4-D,或NAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織,結(jié)果愈傷組織上分化出不少不定根,此帶根愈傷組織在含TDZ和GA3的培養(yǎng)基上分化出不定芽,再生率最高可達(dá)到53%。3激素濃度對運用短工酶誘導(dǎo)愈傷組織的影響在植物組織培養(yǎng)中,外植體愈傷組織的形成與外源激素的作用密不可分,多種激素的綜合使用時,其組合比例、濃度是組培成功最基本的條件。劉軍、豐震、趙蘭勇等研究表明,生長素2,4-D和細(xì)胞分裂素混合使用要比其它組合效果更好。他們經(jīng)過2個多月的培養(yǎng),M4培養(yǎng)基(MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2mg/L+活性炭0.3g/L)上葉片愈傷組織生長正常,增殖快,呈黃綠色,該培養(yǎng)基是誘導(dǎo)葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。林婭、鄭玉梅等通過試驗得出結(jié)論:在愈傷組織誘導(dǎo)時,NAA是適宜的生長素;它與KT或ZT配合,能夠誘導(dǎo)出比較理想的愈傷組織。細(xì)胞分裂素BA、KT、ZT和生長素NAA、2,4-D6種激素中,KT或ZT與NAA組合能夠較好地誘導(dǎo)月季愈傷組織。試驗選擇了含有不同濃度KT和NAA以及ZT和NAA兩組培養(yǎng)基試驗不同激素濃度對月季愈傷組織誘導(dǎo)的影響,結(jié)果表明激素濃度主要影響愈傷組織的顏色和質(zhì)地;一般生長素濃度越高,愈傷組織顏色偏向于黃色,質(zhì)地也越松散;但是有些品種當(dāng)生長素達(dá)到一定濃度時,會發(fā)生不定根;并且不同品種適宜的激素濃度不同。愈傷組織形成后在原培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)接于含有不同濃度ZT和NAA以及含有TDZ、NAA和GA的兩組愈傷組織分化培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,在愈傷組織分化過程中,生長素仍然是必要的;GA對愈傷組織增殖具有負(fù)作用。高莉萍、包滿珠研究發(fā)現(xiàn)適合田間苗葉片分化不定芽的培養(yǎng)基較適合組培苗葉片分化不定芽的培養(yǎng)基對薩蔓莎小葉外植體不定芽的誘導(dǎo)更為有效,前者小葉不定芽的最高誘導(dǎo)率為51.8%,平均誘導(dǎo)率為39.4%,而后者的分別為44.4%和24.1%。在發(fā)枝培養(yǎng)基中,當(dāng)BA濃度為0.5mg/L或1.0mg/L時,生長素使用NAA比使用等濃度的IBA效果好。生長素濃度為0.01mg/L時,不定芽誘導(dǎo)率高于生長素濃度為0.05mg/L時的誘導(dǎo)率,生長素濃度升高,可促進(jìn)愈傷組織生長,但不利于不定芽的分化。他們還發(fā)現(xiàn)各植物生長調(diào)節(jié)劑組合中,經(jīng)誘導(dǎo)適合田間苗葉片分化的培養(yǎng)基黑暗誘導(dǎo)8d后轉(zhuǎn)入含0.5mg/LBA和0.01mg/LNAA的發(fā)枝培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法更適合月季品種薩蔓莎小葉的直接再生,不定芽誘導(dǎo)率為51.8%,平均每葉再生1.4個不定芽。在其它激素組合中,平均每葉再生不定芽數(shù)為1.0～2.4。4活性培養(yǎng)基的添加水解乳蛋白是一種復(fù)合有機添加物,馬純艷、賈景明比較培養(yǎng)基的成分時發(fā)現(xiàn),加了水解乳蛋白的培養(yǎng)基比沒有添加此物質(zhì)的培養(yǎng)基,其外植體周邊變黑程度得以改善,保持活性時間后者的長,愈傷組織比較大,且誘導(dǎo)率也高于后者,所以,他們認(rèn)為水解乳蛋白中可能有某種有機營養(yǎng)物質(zhì)是玫瑰葉培養(yǎng)中必不可少的,為外植體生長提供足夠的必須的營養(yǎng),使其保持旺盛的生命力。5葉片外植體的誘導(dǎo)、分離和再生林婭、鄭玉梅、劉青林研究發(fā)現(xiàn),在暗培養(yǎng)條件下,“薩蔓莎”、“休姆主教”、“寵愛小姐”、“卓越”、“埃菲爾鐵塔”葉片外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織數(shù)量與在光培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)的沒有差異。但是愈傷組織色澤較暗,沒有綠色成分,質(zhì)地也更松散。愈傷組織在相同培養(yǎng)基上繼代暗培養(yǎng)。4周后,“薩蔓莎”愈傷組織在MS+KT0.5mg/L+NAA2.0mg/L培養(yǎng)基上分化出綠色芽體。高莉萍、包滿珠將小葉外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)入發(fā)枝培養(yǎng)基。他們發(fā)現(xiàn),黑暗培養(yǎng)8d對葉片不定芽的誘導(dǎo)最有效,再生率為33.3%,每葉再生的芽數(shù)為1.4。而且延長暗培養(yǎng)時間有利于小葉柄基部生長淡黃色愈傷,不利于不定芽的分化及發(fā)育,因而再生率下降。張常青、洪波、王海琴等在葉柄再生芽的誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn),經(jīng)一定黑暗條件的誘導(dǎo)培養(yǎng)和光周期再生培養(yǎng),不定芽再生可以同時通過愈傷組織發(fā)生和器官直接發(fā)生得到。葉柄外植體在MS添加7μmol/LTDZ的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)10d,再轉(zhuǎn)接到MS添加0.5mg/L6-BA的再生培養(yǎng)基中16h/8h光周期培養(yǎng),可以獲得57.1%的芽再生率。任桂芳、王建紅、馮慧等分別取金秀娃、冰山和火球無菌苗的頂生3片葉分別接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)試驗。結(jié)果表明暗培養(yǎng)30d對月季葉片的分化最為有利,冰山暗培養(yǎng)30d后分化率比無暗培養(yǎng)提高了30.9%。6不同材料對褐化的影響在月季葉片愈傷組織誘導(dǎo)過程中,褐化的發(fā)生比較嚴(yán)重。為降低褐化率,劉軍、豐震、趙蘭勇等認(rèn)為首先要選擇適宜的外植體。所選材料的年齡、取材部位、材料的大小及外植體受