植物生長調(diào)節(jié)劑對南方紅豆杉愈傷組織誘導和生長的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑對南方紅豆杉愈傷組織誘導和生長的影響

南方紅杉（pilg.）reid.var.maiei（lemee等levl.）chengetl.k.fu，又名美麗紅杉）是中國紅杉科的一個新品種。根據(jù)研究，它的樹枝、果皮、葉子、根和果肉都含有較低的紫杉醇，因此有許多關于組織和細胞培養(yǎng)和生產(chǎn)紫杉醇的關于報告。然而，關于植物生長參數(shù)和植物種類的系統(tǒng)研究沒有關于過度組織。它對減少組織損傷組織的影響，發(fā)展和形成過度組織，并對其參與國的組織和質(zhì)量進行了系統(tǒng)研究[3、4、5、6、7、8、9、10、11、12]。所以,我們以其幼莖、較成熟幼莖皮、形成層、幼葉、頂端分生組織為原始誘導材料,以MS附加不同水平和組合的2,4-D、NAA、KT、6-BA為愈傷組織誘導培養(yǎng)基,以B5附加不同水平和組合的2,4-D、NAA、KT、6-BA、GA為生產(chǎn)培養(yǎng)基,結合HPLC法檢測,對該方面進行了比較系統(tǒng)的研究,以探索植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物次生代謝的調(diào)控作用,為組織或細胞大量培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇提供基礎。1材料和方法1.1南方紅杉傷口的組織誘導和培養(yǎng)1.1.1自本室資源收集場原始外植體:南方紅豆杉幼莖、較成熟幼莖皮、形成層、幼葉、頂端分生組織均自本室資源收集圃所采南方紅豆杉(1996年引種于桑植八大公山自然保護區(qū)所培育約7年生苗)春梢(莖皮為綠色)上獲得。1.1.2幼葉枝梢預處理將野外材料洗凈后分剪成較成熟幼莖、嫩枝、帶幼葉枝梢三個部分,然后分別進行表面消毒處理。將帶幼葉枝梢先用自來水沖洗干凈,晾干表面水后,分別用75%酒精浸泡5s、0.1%HgCl浸泡20min,無菌水清洗7次后備用;將較成熟幼莖和嫩枝先用自來水沖洗2h,晾干表面水后分別用75%酒精浸泡15s、0.1%HgCl浸泡20min,無菌水清洗7次后備用。1.1.31.1.4正皮、細葉的分離培養(yǎng)莖段:將已經(jīng)消好毒的幼莖切去其上葉片,再切成0.5cm長的小段接入誘導培養(yǎng)基中。較成熟幼莖皮:將已消好毒的較成熟幼莖用手術刀小心刮去表面栓皮,后剝?nèi)≈芷?將皮切成約0.5×0.5cm小塊接入誘導培養(yǎng)基中(注意剝?nèi)≈芷r不要傷及形成層),裸莖桿留作削取形成層用。形成層:用手術刀小心切削剝皮后裸莖上的表面形成層組織,然后切成小塊接入培養(yǎng)基。發(fā)育未成熟幼葉:將已消毒帶幼葉枝梢上發(fā)育未成熟幼葉自葉柄基部切下,后切成0.5cm長小段接入誘導培養(yǎng)基中。頂端分生組織:用尖頭鑷子從取過幼葉的枝梢頂端挑取頂端分生組織,接入誘導培養(yǎng)基中。接種量:每一個處理接5瓶(5個重復),每瓶接5塊外植體,共計有40組實驗、200個重復、約1000個外植體。1.1.5交替培養(yǎng),誘導培養(yǎng)暗誘導培養(yǎng):溫度25±1℃、濕度85%±5%和溫度23±1℃、濕度80%±5%條件下各暗培養(yǎng)12h交替進行,誘導培養(yǎng)7d。弱光誘導培養(yǎng):經(jīng)暗培養(yǎng)7d后,轉為每天白天溫度25±1℃、濕度85%±5%、光照1000～1200Lx弱光,夜晚溫度23±1℃、濕度80%±5%黑暗條件下12h。1.1.6愈傷組織誘導時間誘導時間:外植體接入誘導培養(yǎng)基后每天觀察一次,每個處理5個重復中第1塊外植體長出愈傷組織所需時間即為該處理的愈傷組織誘導時間。計算愈傷組織誘導率的公式:在繼代培養(yǎng)前觀察記錄愈傷組織的顏色、形狀和生長狀態(tài)。1.2種外植體的增殖培養(yǎng)選取在8種誘導培養(yǎng)基(表1)上誘導、繼代培養(yǎng)了3代以上、黃綠色、生長旺盛、結構疏松、大小一致的5種外植體來源愈傷組織,在無菌條件下轉接到8種生產(chǎn)增殖培養(yǎng)基(表2)上進行增殖繼代培養(yǎng),每一個處理接5瓶(5個重復),每瓶接5塊愈傷組織,共計有40組實驗、200個重復、約1000塊愈傷組織,接入的每塊愈傷組織大小基本保持一致。1.2.1循環(huán)培養(yǎng)時間于25±1℃、濕度85%±5%,1000Lx左右光下12h,23±1℃、濕度80%±5%,黑暗12h,連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)2代(每代培養(yǎng)30d)。1.2.2選取總體生長量的方法愈傷組織塊直徑月平均生長量:經(jīng)誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)所獲得愈傷組織繼代接入生產(chǎn)增殖培養(yǎng)基后每三天觀測一次(共觀測10次),用直尺量取每塊愈傷組織最大方向上的直徑Dd+2(mm),5瓶共25塊愈傷組織每3d第3d最大方向直徑的和為∑Dd+225,若前一次觀測的和為∑Dd25,則∑Dd+225-∑Dd25即為當次觀測每處理5重復25塊愈傷組織直徑3d的總生長量,觀測次數(shù)為10次,每處理每塊愈傷組織直徑的月均生長量的公式:同時觀察記錄愈傷組織的顏色、形狀和生長狀態(tài)。1.3紫杉醇含量測定1.3.1材料表面將在生產(chǎn)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)了2代的愈傷組織按來源和處理不同分別收集凍藏待測。1.3.2標準紫杉醇溶液的制備用十萬分之一天平準確稱取紫杉醇對照品2.94mg,用甲醇(色譜純)溶解定容至10mL備用。1.3.3流動相、色譜相、柱溫度色譜柱:SciencehomeC18(4.60×250mm,5μm);流動相:甲醇∶乙腈∶水(25∶35∶45,v/v/v);進樣量:5μL(未經(jīng)處理對照品為1μL);靈敏度:0.01Aufs;流速:1mL/min;柱溫:40℃;檢測波長:227nm。1.4儀器和試劑1.4.1水浴和蒸發(fā)設備LC-9A高效液相色譜儀(日本島津);SPD-6AV紫外檢測器(日本島津);R-210薄膜旋轉蒸發(fā)儀(日本);UC-55N恒溫水浴(日本);AEL-4OSM十萬分之一天平(日本島津);冷凍干燥器;FD-230型紅外水分計(日本);生長室(LPH-300);無菌操作臺(CCV-1311);高壓蒸汽滅菌鍋(SM-52);干熱滅菌箱(SG-62);過濾裝置;萃取裝置。1.4.2試劑和藥物除HPLC檢測所用試劑與藥品為色譜純外,其余均為分析純。紫杉醇對照品購于中國藥品生物制品檢定所。2結果與分析2.1植物生長添加劑對促進和治療南方紅杉傷口的組織培養(yǎng)的影響2.1.1組合4,4-d或3-d結果顯示,植物生長調(diào)節(jié)劑各組合對南方紅豆杉幼莖和較成熟幼莖皮的影響比較一致,2,4-D與NAA適當?shù)慕M合較有利二者愈傷組織的快速誘導,似乎與2,4-D/NAA的比值有關,組合為2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA(比值為4)時的明顯不如組合為0.5mg/L2,4-D+3mg/LNAA(比值約為0.17),在有6-BA存在時差異更加明顯(MS7與MS8),較低的該比值(0.16～0.3)較為有利。較高的2,4-D(MS1:3mg/L)、或較低的2,4-D(MS5:1.5mg/L)適當增補KT(0.5mg/L)均較有利于幼葉愈傷組織的誘導,NAA對幼葉愈傷組織的快速誘導不太適合。頂端分生組織啟動最快,較低水平的2,4-D或NAA對其起動更有利,這可能與其本身的內(nèi)源生長素水平較高有關。形成層組織在各組合的作用下均未啟動,可能是取材不當所致?？偟目磥?2,4-D/NAA高于0.4時(MS7),不利于南方紅豆杉愈傷組織的誘導。2.1.2d/naa對南方紅豆愈傷組織的誘導結果與2.1.1的相接近,誘導率的結果進一步證明,2,4-D/NAA的組合對南方紅豆杉愈傷組織的誘導影響較大,其比率大小應據(jù)材料不同而定。3mg/L2,4-D條件下幼莖的誘導率只有5%的結果,是非正常現(xiàn)象,可能是材料和接種的原因所致。2.1.3影響受影響組織的生長表5表中所示結果與上述誘導率結果基本相對應,除深褐色外,其它生長狀態(tài)均為正常。皮和葉愈傷組織的顏色相對偏深。2.2植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對南方紅杉各階段組織生長和紫杉醇合成量的影響2.2.1植物生長調(diào)節(jié)劑的使用對愈傷組織生長的影響結果顯示,在生產(chǎn)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的第一個月內(nèi),植物生長調(diào)節(jié)劑的作用極顯著,如幼莖皮愈傷組織,其愈傷組織塊最大方向直徑的月均生長量最高是最低的約10倍,以2,4-D附加適當水平的KT為佳;頂端分生組織的是近18倍,形成層的是5倍多,幼莖和幼葉愈傷組織的差異雖不如上述顯著,但最高也是最低的2倍多(表6)。愈傷組織生長狀態(tài)與其生長量相對應,如幼莖皮愈傷組織在2mg/L2,4-D和3mg/LNAA+0.1mg/LKT兩個組合下的生長量均較低,其愈傷組織的顏色均為深褐色,其它幾種也是一樣,凡褐色、深褐色愈傷組織的生長量均較低,但少數(shù)淺褐色愈傷組織的生長量較高(表8)。進入增殖繼代培養(yǎng)第2個月后,所采用植物生長調(diào)節(jié)劑各組合對各愈傷組織作用間的差異性出現(xiàn)顯著縮小的趨勢(表7)。如幼莖皮愈傷組織,最高與最低之間由原來的10倍降到了2倍多一點,頂端分生組織由18倍也降到了2倍多,原2倍者則已幾乎沒有了差異。愈傷組織的生長狀態(tài)更是如此,經(jīng)第2個月培養(yǎng)后,顏色均接近黃綠色,且生長均較疏散。這與所采用植物生長調(diào)節(jié)劑組合均參考各文獻的優(yōu)化組合有關,說明對南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)有利的植物生長調(diào)節(jié)劑組合可能有多種。2.2.2-d和kt配比對愈傷組織紫杉醇合成的影響HPLC檢測(圖1)結果(表9)顯示,植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對南方紅豆杉各外植體來源愈傷組織紫杉醇合成量的影響,即存在不同調(diào)節(jié)劑組合對同一種愈傷組織紫杉醇合成水平的影響差異(表9縱行中的差異),也存在同一調(diào)節(jié)劑組合對不同種愈傷組織作用效果的差異(表9橫行中的差異),且兩方面的差異都極顯著。根據(jù)檢測圖譜(圖1),分離效果較好,結果完全可以作為依據(jù)。2mg/L2,4-D僅對幼莖愈傷組織合成紫杉醇有利,其愈傷組織中紫杉醇積累達到了0.026%,其它愈傷組織中的紫杉醇合成似乎受到了抑制,幾乎未檢測出含量。2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT僅對葉愈傷組織有利,測得紫杉醇含量達為0.027%(圖1A),與莖的相接近。2mg/L2,4-D+1mg/LKT+0.5mg/LGA對幼莖也較有利,其作用下愈傷組織中紫杉醇含量達0.023%(圖1C),且對頂端分生組織愈傷組織也有一定作用,其中檢測到了0.005%的紫杉醇含量。1.5mg/L2,4-D+0.5mg/LKT組合對南方紅豆杉愈傷組織紫杉醇的合成也較有利,在其作用下,幼葉和頂端分生組織的愈傷組織中分別檢測到了0.012%和0.009%的紫杉醇含量。2mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA對頂端分生組織愈傷組織紫杉醇的合成表現(xiàn)出抑制作用,對其他則是否影響不大。但對愈傷組織生長最有利,該組合培養(yǎng)基上愈傷組織的月平均生長量最高。2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA、0.5mg/L2,4-D+1mg/LNAA+0.5mg/LKT、3mg/LNAA+0.1mg/LKT3個組合作用下,各愈傷組織中均未檢測出或檢出很低紫杉醇的含量。且對生長的作用也不是太顯著。由此認為,適當水平(2mg/L)的2,4-D單用,或增補適當水平的KT、KT+GA、6-BA配合使用,均較有利于南方紅豆杉愈傷組織紫杉醇的生物合成,而NAA則似乎不太有利于其紫杉醇的合成。C2、C4、C7的結果是否與所加入CH、CoconutWater天然復合物有關,還有待實驗驗證。3南方紅豆愈傷組織紫杉醇合成的優(yōu)化本實驗所采用植物生長調(diào)節(jié)劑種類和水平的各個組合均根據(jù)蘇應娟、趙芳等文獻所報道的最優(yōu)組合設計而成。結果表明,在誘導初期NAA較2,4-D要好,且表現(xiàn)出較強依賴調(diào)節(jié)劑組合的差異性,但隨培養(yǎng)時間的加長,植物生長調(diào)節(jié)劑作用的差異性更多受愈傷組織植物組織細胞學起源差異性的影響。經(jīng)過幾代培養(yǎng)后,愈傷組織生長相關各方面的差異性均迅速縮小,直至無顯著性差異。由此認為,南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)存在多個植物生長調(diào)節(jié)劑的優(yōu)化組合,本實驗中所應用8種誘導培養(yǎng)基和8種生產(chǎn)培養(yǎng)基,除個別(如MS7等)應加以改進外,其余均可作為南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基,并可根據(jù)初期的差異表現(xiàn)結合紫杉醇生產(chǎn)對其實施進一步優(yōu)化改進。根據(jù)結果,南方紅豆杉愈傷組織合成紫杉醇即受植物生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)控影響,又存在著愈傷組織不同外植體起源間的差異。2,4-D對南方紅豆杉愈傷組織紫杉醇的合成有促進作用,而NAA則似乎不太有利,這可能與2,4-D作為除草劑的獨特作用機理有關,