豬卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑毒性試驗(yàn)

豬卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑毒性試驗(yàn)

減少對(duì)豬卵細(xì)胞的冷凍保護(hù)，提高卵母細(xì)胞在冷凍后的發(fā)育潛力，對(duì)基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。近年來,豬卵母細(xì)胞冷凍取得了一些進(jìn)展,但其凍后發(fā)育潛能依然很低。Fujihira等報(bào)道,玻璃化冷凍豬未成熟(GV期)卵母細(xì)胞,解凍后體外成熟并進(jìn)行胞漿內(nèi)單精注射(ICSI),結(jié)果獲得13.5%的囊胚發(fā)育率。Rojas等報(bào)道,豬體外成熟(MⅡ期)卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后再行體外受精(IVF),其卵裂率為10.4%。從總體上看,豬卵母細(xì)胞的冷凍保存現(xiàn)階段仍主要集中于對(duì)冷凍液、冷凍載體、冷凍-解凍程序和采用去脂處理等方面的研究上,以期提高冷凍保存效果。本試驗(yàn)旨在研究多種冷凍保存方案對(duì)豬卵母細(xì)胞凍后發(fā)育能力的影響,以期建立有效的冷凍保存豬卵母細(xì)胞的操作程序,為地方優(yōu)良豬種的資源保存建立技術(shù)平臺(tái)。1材料和方法1.1卵丘-卵母細(xì)胞的采集從南京市哈慈天環(huán)食品有限公司下屬屠宰場采集豬卵巢,置于37～39℃生理鹽水(含青、鏈霉素各500IU/mL)中,2h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。用添加1%新生牛血清(NCS)的杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)洗卵巢3～4次,采用抽吸法采集卵巢表面Φ2～5mm卵泡卵母細(xì)胞,實(shí)體顯微鏡下?lián)烊“|(zhì)均勻、包被3層及其以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC);采集的COC用培養(yǎng)液洗2～3次備用。撿卵后留下的豬卵泡液(Porcinefollicularfluid,pFF)收集于10mL離心管中,以1500r/min離心5min,收集上清液,以0.22μm濾器過濾后分裝保存于-20℃?zhèn)溆谩?.2基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備基礎(chǔ)培養(yǎng)液為TCM199,添加10%NCS、0.36mg/L丙酮酸鈉、1mL/L乳酸鈉、70mg/L青霉素和50mg/L鏈霉素。成熟培養(yǎng)液是在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中,另添加10%pFF、10IU/mL孕馬血清促性腺激素(PMSG)、10IU/mL人絨毛膜促性腺激素(hCG)、69μg/mLL-半胱氨酸和1μg/mL17β-雌二醇(E2)。卵母細(xì)胞于成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后,再轉(zhuǎn)入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)20h。培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2和飽和濕度。經(jīng)培養(yǎng)后,卵母細(xì)胞排出第一極體(pbI)或卵丘擴(kuò)散至卵母細(xì)胞直徑5倍以上者判為成熟。1.3評(píng)估蔗糖全球培養(yǎng)用本實(shí)驗(yàn)室所建立的OPS法冷凍豬GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞,方法是卵母細(xì)胞先在20%乙二醇(EG)TCM199冷凍液中平衡5min,轉(zhuǎn)入40%EG+0.5mol/L蔗糖TCM199冷凍液(停留時(shí)間不超過30s)中裝入OPS管,每管裝5枚卵母細(xì)胞和約2μL玻璃化冷凍液。裝管后立即投入-196℃液氮中冷凍保存。解凍時(shí),從液氮取出OPS管直接放入37℃0.5mol/L蔗糖溶液中,回收卵母細(xì)胞;平衡5min后,將回收的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入0.25mol/L蔗糖溶液再平衡5min,然后用TCM199培養(yǎng)液洗2～3次備用。1.4冷冷凍卵母細(xì)胞的測定1.4.1正常形態(tài)者所占的百分率形態(tài)正常率是指卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍-解凍后,保持正常形態(tài)者所占的百分率。解凍后形態(tài)正常的卵母細(xì)胞基本保持凍前的形態(tài)特征,細(xì)胞無碎裂,卵丘無脫落,卵母細(xì)胞胞質(zhì)飽滿、均一,透明帶完整。1.4.2熒光顯微鏡檢查解凍的卵母細(xì)胞置于5μg/mLFDA(SIGMA)染液中,于38.5℃孵育3min,用TCM199洗2～3次后,置于熒光顯微鏡下檢查。發(fā)強(qiáng)熒光者判為存活卵母細(xì)胞,不發(fā)熒光或熒光微弱者判為死亡;以發(fā)強(qiáng)熒光者所占的百分率計(jì)算凍后卵母細(xì)胞的存活率。1.5豬卵母細(xì)胞的體外受精ivf和胚胎培養(yǎng)1.5.1去除卵丘細(xì)胞培養(yǎng)44h后,將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入0.1%透明質(zhì)酸酶中,38.5℃孵育15min,微吸管吹打去除卵丘細(xì)胞。挑選胞質(zhì)飽滿均勻、排出pbI的卵母細(xì)胞,分別用TCM199培養(yǎng)液和獲能液(mTBM)洗2～3次,移入上覆石蠟油并在CO2培養(yǎng)箱中過夜平衡的mTBM微滴(50μL)中,每滴置卵母細(xì)胞15～20枚,放入CO2培養(yǎng)箱中,等待受精。1.5.2懸浮精子的提取用37℃平衡0.5h的精子清洗液(DPBS)與mTBM液對(duì)精子進(jìn)行處理。取1mLDPBS加入盛有1mL新鮮精液的離心管中離心(3000r/min,5min)、棄上清;再加入2mL的DPBS,吹打懸浮精子后再離心、棄上清,加入2mLmTBM,懸浮精子沉淀。離心棄上清后,用含有肝素(100μg/mL)的mTBM調(diào)節(jié)精子濃度至1.0×106個(gè)/mL,備用。1.5.3體外經(jīng)濟(jì)取50μL備用精子,加入等待受精的卵母細(xì)胞微滴中,于38.5℃、5%CO2氣相、飽和濕度條件下共同孵育6～8h。1.5.4完善粗胞培養(yǎng)方法精卵共同孵育6～8h后,轉(zhuǎn)入預(yù)平衡的NCSU-23培養(yǎng)液中洗3～4次,每10～15枚假定受精卵置于100μLNCSU-23微滴中,于38.5℃、5%CO2氣相、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.6試驗(yàn)組1.6.1體外受精和fpss檢測GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞不作冷凍,只經(jīng)冷凍前后的處理程序,研究室溫條件下本試驗(yàn)所用冷凍液的毒性作用及其對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。其中GV期卵母細(xì)胞對(duì)照組直接采用GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)、體外受精和FDA染色,不接觸冷凍液。GV期卵母細(xì)胞處理組是將卵母細(xì)胞先置入20%EGTCM199液5min,再轉(zhuǎn)入40%EG+0.5mol/L蔗糖TCM199液30s,最后分別于0.5mol/L蔗糖和0.25mol/L蔗糖TCM199液中各處理5min,以10%NCSTCM199洗2～3次后,進(jìn)行體外成熟、體外受精和FDA染色。MⅡ期卵母細(xì)胞來源于GV期卵母細(xì)胞的體外成熟,其對(duì)照組是將卵母細(xì)胞直接用于體外受精和FDA染色;處理組使用冷凍保護(hù)劑的處理方法同GV期卵母細(xì)胞處理組,處理后直接進(jìn)行體外受精和FDA染色。1.6.2體外成熟、外受精與胚胎培養(yǎng)按“1.4”進(jìn)行豬卵母細(xì)胞的冷凍和解凍,試驗(yàn)設(shè)計(jì)成3組:I組為對(duì)照組,GV期卵母細(xì)胞不作任何處理,直接進(jìn)行體外成熟、FDA染色、體外受精與胚胎培養(yǎng);II組為GV期卵母細(xì)胞冷凍組,經(jīng)冷凍-解凍后,進(jìn)行體外成熟、FDA染色、體外受精與胚胎培養(yǎng);III組為MⅡ期卵母細(xì)胞冷凍組,該組卵母細(xì)胞來源于GV期卵母細(xì)胞的體外成熟,經(jīng)冷凍-解凍后,作FDA染色、體外受精與胚胎培養(yǎng)。1.7處理數(shù)據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1體外受精胚卵裂率GV期與MⅡ卵母細(xì)胞分組處理后,其FDA染色存活率、體外成熟率和體外受精胚卵裂率見表1。表1顯示,經(jīng)歷冷凍保護(hù)劑處理后,GV期卵母細(xì)胞存活率、體外成熟率及體外受精胚卵裂率雖略低于對(duì)照組(85.9%,72.4%和50.9%對(duì)91.3%,73.9%和53.3%),但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);試驗(yàn)組MⅡ期卵母細(xì)胞存活率雖顯著低于其對(duì)照組(84.2%對(duì)92.6%,P<0.05),但其體外受精胚卵裂率則與對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05);GV期與MⅡ期卵母細(xì)胞相比,兩者經(jīng)冷凍保護(hù)劑處理后,其存活率、體外受精胚卵裂率均無顯著差異(P>0.05)。2.2不同發(fā)育時(shí)期卵母細(xì)胞的體外成熟率和卵裂率豬GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍-解凍后,抽檢其凍后形態(tài)正常率、FDA染色存活率、體外成熟率與卵裂率,結(jié)果見表2。表2表明,經(jīng)OPS法玻璃化冷凍后,GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞均獲得較高的形態(tài)正常率(92.4%對(duì)94.2%,P>0.05),但GV期卵母細(xì)胞凍后存活率要顯著高于MⅡ期卵母細(xì)胞(56.8%對(duì)41.9%,P<0.05)。經(jīng)玻璃化冷凍后,GV期卵母細(xì)胞的體外成熟率和卵裂率都比新鮮卵母細(xì)胞要顯著下降(42.6%和7.79%對(duì)73.9%和53.3%,P<0.05),而MⅡ期卵母細(xì)胞冷凍-解凍后經(jīng)體外受精,未獲得卵裂。在GV期卵母細(xì)胞冷凍組,154枚卵母細(xì)胞凍后經(jīng)體外成熟、體外受精及體外培養(yǎng),共有12枚發(fā)生卵裂,其中6枚發(fā)育至8-細(xì)胞,3枚發(fā)育至16-細(xì)胞,3枚發(fā)育至桑椹胚。3討論3.1不同冷凍保護(hù)劑對(duì)gv期卵母細(xì)胞的影響冷凍保護(hù)劑可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍傷害,合理選擇冷凍保護(hù)劑對(duì)卵母細(xì)胞的冷凍至關(guān)重要。有關(guān)豬卵母細(xì)胞冷凍保存的報(bào)道相對(duì)較少、冷凍效率偏低,多數(shù)研究集中于冷凍劑種類與使用濃度上。Huang等以細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來研究甘油、二甲亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、1,2-丙二醇(PROH)4種常用的冷凍保護(hù)劑對(duì)豬卵母細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示,無論在室溫或10℃,甘油做冷凍保護(hù)劑時(shí)GV期卵母細(xì)胞的存活率要低于其他組;在10℃,EG做冷凍保護(hù)劑時(shí)MⅡ期卵母細(xì)胞的存活率要高于其他3組(40%對(duì)23%～26%,P<0.05)。這說明在豬卵母細(xì)胞冷凍上,各種冷凍保護(hù)劑均具有保護(hù)作用,但效果不一樣,甘油的效果較差,EG相對(duì)較好。在冷凍保存研究中,EG常被用作滲透性冷凍保護(hù)劑、蔗糖為非滲透性冷凍保護(hù)劑。因此,本試驗(yàn)選擇EG和蔗糖組成玻璃化冷凍液,以期在保證冷凍保護(hù)效果的同時(shí),最大限度地減少冷凍保護(hù)劑對(duì)卵母細(xì)胞的毒性作用。冷凍液的化學(xué)毒性不僅與其種類有關(guān),而且與其所用濃度和處理時(shí)間有關(guān)。當(dāng)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入冷凍液時(shí),隨著時(shí)間的延長和濃度的不同,會(huì)影響到細(xì)胞膜的通透性與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,甚至?xí)淖兩锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)與功能,最終使卵母細(xì)胞發(fā)育能力受損。本研究以卵母細(xì)胞存活率、體外成熟率和體外受精胚卵裂率及其后續(xù)的發(fā)育為受試指標(biāo),試驗(yàn)表明,所用冷凍液與處理程序無論對(duì)GV期還是對(duì)MⅡ期卵母細(xì)胞,并不構(gòu)成明顯的毒性作用,可用于卵母細(xì)胞冷凍保存研究。3.2不同成熟時(shí)間的卵母細(xì)胞在不同冷凍保存的的影響目前,國內(nèi)外許多研究集中于不同時(shí)期卵母細(xì)胞的冷凍保存,但哪一時(shí)期卵母細(xì)胞的冷凍效果更好?仍頗有爭議。MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體對(duì)低溫耐受性很低,凍后卵母細(xì)胞紡錘體的恢復(fù)能力與其損傷程度、解凍后培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。而成熟卵母細(xì)胞的紡錘體對(duì)于體外受精、第二極體排出和原核遷移都是十分重要的。一旦紡錘體解聚,則會(huì)導(dǎo)致染色體分離,體外受精失敗,發(fā)育終止。人卵母細(xì)胞在室溫放置30min,紡錘體就完全解聚,復(fù)溫后僅25%～50%可恢復(fù)紡錘體結(jié)構(gòu)。牛體外成熟卵母細(xì)胞在4℃保持10～20min,紡錘體可完全解聚,而豬卵母細(xì)胞在4℃僅5min,就會(huì)發(fā)生部分或完全解聚。在未成熟(GV期)卵母細(xì)胞,染色體存在于核內(nèi),不存在成熟紡錘體結(jié)構(gòu)。GV期和MII期卵母細(xì)胞的這一差異,或許可以解釋本研究中GV期卵母細(xì)胞比MⅡ期要具有更大的耐凍性。試驗(yàn)中GV期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后,再經(jīng)體外成熟、體外受精,獲得7.79%的卵裂率,而MⅡ期則未獲得卵裂。這一結(jié)果顯著低于新鮮卵母細(xì)胞的卵裂與發(fā)育,表