營養(yǎng)期污染的產(chǎn)生原因及控制措施

營養(yǎng)期污染的產(chǎn)生原因及控制措施

污染是植物組織培養(yǎng)過程中的一個(gè)普遍問題。外植體材料、培養(yǎng)基、接種工具、接種室消毒不嚴(yán)格或無菌操作不規(guī)范及植物的內(nèi)生菌的存在等因素均可導(dǎo)致污染的發(fā)生。培養(yǎng)物受到污染在組織培養(yǎng)中是經(jīng)常遇到的,而且它還是一個(gè)很難控制的問題,若不能把污染率降低到可以接受的范圍,那就意味著組織培養(yǎng)工作的中斷,最后以失敗告終,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,分析污染的產(chǎn)生,進(jìn)而控制污染成了植物組織培養(yǎng)中的重要工作。本研究以麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院組織培養(yǎng)中心月季快速繁殖過程中所出現(xiàn)的各種污染為取樣對象,分析產(chǎn)生污染的原因,鑒定污染物中的微生物種類,確定污染的源頭,進(jìn)而有針對性地設(shè)計(jì)并落實(shí)一些控制措施,以期減輕或防止組織培養(yǎng)過程中污染的產(chǎn)生,同時(shí)也期望為植物組織培養(yǎng)工作控制污染的發(fā)生提供一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。1材料和方法1.111個(gè)月的集體培訓(xùn)過程1.1.1培養(yǎng)基的制備芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA0.8mg/L+NAA0.01mg/L;繼代培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L;根誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.5mg/L。在以上培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L、瓊脂6g/L,pH值調(diào)至5.8。1.1.2培訓(xùn)條件培養(yǎng)溫度22~24℃;每天光照12h;光照度2000lx左右。1.1.3叢生芽的培養(yǎng)以健壯月季的帶芽莖段為外植體,將其進(jìn)行常規(guī)消毒后接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,經(jīng)過14d的培養(yǎng)后,待腋芽伸長達(dá)1cm左右時(shí),將其切下,進(jìn)行繼代培養(yǎng)。以后每隔28d將叢生芽繼代培養(yǎng)1次。當(dāng)所誘導(dǎo)的芽長到2~3cm時(shí)將其切下,轉(zhuǎn)接到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根,經(jīng)過21d的培養(yǎng),形成帶根系的再生植株,最后進(jìn)行移栽。1.2培養(yǎng)物的收集根據(jù)月季組織培養(yǎng)的不同培養(yǎng)時(shí)段,分階段收集各種受到污染的培養(yǎng)物。收集時(shí)盡量多挑選形態(tài)各異的污染物為試驗(yàn)材料,共收集18份。按培養(yǎng)時(shí)段的不同,分為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)污染物11份,繼代培養(yǎng)時(shí)5份,根誘導(dǎo)時(shí)收集到2份污染材料。1.3d左右的時(shí)間由于月季組織培養(yǎng)時(shí)間長,從初代培養(yǎng)到完成生根培養(yǎng),最后移栽到溫室,需45d左右的時(shí)間。而微生物的生長周期短、繁殖速度快,在組織培養(yǎng)過程中的溫度、濕度、營養(yǎng)及培養(yǎng)基的pH等正是微生物生長的最佳條件,因此就會有眾多的機(jī)會使培養(yǎng)瓶內(nèi)的各種污染發(fā)生、發(fā)展,最后影響到培養(yǎng)物的正常生長。1.4純分離和鑒定微生物菌落純種的分離鑒定方法常用的有稀釋法、平板劃線分離法和單細(xì)胞挑取法等。本研究采用平板劃線分離法進(jìn)行操作。(1)平板培養(yǎng)基的制備在嚴(yán)格的無菌操作基礎(chǔ)上,將經(jīng)高溫高壓蒸氣滅菌已冷卻至約50℃的瓊脂培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用)、察氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)霉菌用)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(培養(yǎng)真菌用)等分別倒入無菌的培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿裝量約為15mL,凝固后制成平板培養(yǎng)基。(2)種環(huán)挑取液表面形態(tài)將18個(gè)樣品以較小的稀釋度制成菌懸液,然后用無菌的接種環(huán)挑取1環(huán)菌液于平板上進(jìn)行劃線。操作時(shí),左手持平板培養(yǎng)基,右手持接種環(huán),左手食指將皿蓋掀起一小縫,伸進(jìn)帶有菌液的接種環(huán),在平板培養(yǎng)基上以交叉劃線法進(jìn)行劃線。(3)培養(yǎng)抗菌劑將劃線后的培養(yǎng)皿倒置于瓷盤中(以防冷凝水沖散菌體),放在28~30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~3d后,待培養(yǎng)出菌落后,挑選單個(gè)菌落移入斜面培養(yǎng)。重復(fù)分離3次,得到純種。最后,把分離所得的純菌種進(jìn)行載片培養(yǎng),進(jìn)而經(jīng)顯微鏡檢查鑒定。2結(jié)果2.1養(yǎng)基抗菌的特性通過對18份受污染的月季培養(yǎng)物的觀察,發(fā)現(xiàn)在這些培養(yǎng)瓶內(nèi)出現(xiàn)了不同癥狀、色彩和大小的微生物菌落。隔著培養(yǎng)瓶有的可清楚地看到培養(yǎng)基表面的黑色菌落,由開始的小黑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大,形成邊緣不整齊的圓形,而其表面粗糙絮狀,呈現(xiàn)出黑色疏松的粉狀堆積;有的培養(yǎng)基表面有淡綠色的圓形菌落,也呈粗糙不平的松絮狀,發(fā)展到后期會發(fā)黑形成孢子粉的堆積,打開瓶蓋可聞到一股刺鼻的霉味;其他有的在莖段上長出白色的霉斑,或一些粉紅色、灰黃色、淡黃色的菌落等。菌落除了在培養(yǎng)基的表面生長覆蓋之外,還可沿培養(yǎng)基的裂縫、外植體或叢生芽基部向下擴(kuò)展,嚴(yán)重的擴(kuò)展到整個(gè)培養(yǎng)基。在其生長中分泌出各種次生代謝產(chǎn)物及色素使培養(yǎng)基被染色,呈現(xiàn)黃色、紅色、粉紅色。同時(shí)分泌毒素抑制或殺死外植體、叢生芽或組織培養(yǎng)苗。從以上的特征分析,污染的產(chǎn)生可歸類為細(xì)菌污染與真菌污染。在月季組織培養(yǎng)中,經(jīng)觀察對照,發(fā)現(xiàn)在染菌后,腋芽生長受到了影響,叢生芽稀少,生長緩慢,并在芽尖上有發(fā)黃、枯、黑褐的現(xiàn)象,有爛葉發(fā)生;而在生根培養(yǎng)時(shí)雜菌的感染可使其不生根或生根短、根稀,甚至爛根,根的顏色發(fā)灰;綠葉黃化、枯萎、卷曲,最終導(dǎo)致整株死亡。2.2不同培養(yǎng)階段常見的細(xì)菌、真菌種類及培養(yǎng)對象分析通過分離鑒定,在污染物中共獲得細(xì)菌9個(gè),真菌菌種26個(gè),詳見表1,2。從表1中可以看出,污染月季組織培養(yǎng)的9個(gè)細(xì)菌菌種中,腸桿菌屬所占的比例最大,共4個(gè),占細(xì)菌總數(shù)的44.5%;棒桿菌屬次之,有2個(gè),占22.2%,兩者之和占了細(xì)菌總數(shù)的66.7%;而從表2真菌鑒定結(jié)果看,地霉屬、曲霉屬、毛霉屬、根霉屬的真菌個(gè)數(shù)達(dá)到23個(gè),占真菌總數(shù)的88.5%。從各種菌類所處的培養(yǎng)階段看,誘導(dǎo)培養(yǎng)階段出現(xiàn)的細(xì)菌與真菌種類,有10屬的34個(gè)種類;在生根階段,出現(xiàn)的有7個(gè)屬的30個(gè)種類,而表1,2中所列的所有細(xì)菌與真菌在增殖階段都可以找到,這一切表明污染會發(fā)生在組織培養(yǎng)的每一個(gè)培養(yǎng)階段。2.3污染發(fā)生的原因和控制措施2.3.1接種人員消毒處理不到位(1)接種室環(huán)境雜菌含量過高。(2)接種時(shí),接種工具滅菌時(shí)間短,操作沒有嚴(yán)格按照要求進(jìn)行。(3)接種人員自身消毒不嚴(yán)。(4)外植體——帶芽莖段消毒處理不完全。(5)繼代、生根培養(yǎng)等階段培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)接操作比較粗糙,將微生物帶入培養(yǎng)瓶內(nèi),引起新的污染。2.3.2控制措施針對以上原因,對整個(gè)組織培養(yǎng)工作進(jìn)行改進(jìn),采取了一些措施。(1)水擦試的消毒與滅菌用70%的酒精噴霧降塵消毒,用消毒水擦試地面、墻壁、工作臺等;用紫外線照射消毒;用甲醛加少量的KMnO4熏蒸滅菌。仔細(xì)做好實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生。(2)工作臺超凈工作臺使用前打開工作臺紫外燈,照射20min;操作前10min使超凈工作臺處于工作狀態(tài),讓過濾空氣吹拂工作臺面和四周臺壁,然后關(guān)閉紫外燈,用70%的酒精擦拭工作臺面,以確保工作臺處于無菌狀態(tài)。(3)植體消毒滅菌不徹底在月季莖段快繁中,出現(xiàn)雜菌污染了整個(gè)莖段的現(xiàn)象或僅在莖段的基部出現(xiàn)雜菌,這都是外植體消毒滅菌不徹底的后果。因此,在選擇莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí),可采用2次滅菌法,即將月季莖段用70%酒精浸泡30s,以0.1%升汞處理8min,無菌水沖洗5次后,再用2%的次氯酸鈉液消毒10min,在無菌水沖洗3~5次后接種,效果較好。(4)接種器械的燒瓶口接種前雙手用70%的酒精擦洗,接種時(shí)要用火焰燒瓶口,轉(zhuǎn)動瓶子使瓶口各部分都能燒到;接種器械要反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上灼燒滅菌;接種期間要經(jīng)常用70%的酒精擦試工作臺和雙手。(5)組織培養(yǎng)材料的選擇一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶內(nèi)有污染產(chǎn)生,應(yīng)立即采取合適的方法進(jìn)行處理。對感染雜菌的培養(yǎng)瓶應(yīng)在專門處理室內(nèi)將培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)苗或外植體等連瓶一起(不能打開瓶蓋),先進(jìn)行高壓蒸氣滅菌,然后再進(jìn)行清洗處理;未處理前不能將它們轉(zhuǎn)接到其他培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng),不能隨意棄置,以防擴(kuò)大污染和在周圍環(huán)境中的傳播。組織培養(yǎng)中的植物材料選取受到一定的限制,因此要注意節(jié)約使用。在組織培養(yǎng)苗受污染后,若污染的程度不是很重,則有必要進(jìn)行再處理,消滅污染的雜菌,使植物材料能再次利用,減輕組織培養(yǎng)中取材困難的問題。許婉芳等在抑菌劑對金線連組織培養(yǎng)中微生物污染的抑制實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)50%的多菌靈效果優(yōu)于70%甲基托布津和25%的甲霜靈,其抑菌率100%,且能促進(jìn)金線連的生長;李穎等將已被雜菌污染的銀白楊、四倍體刺槐、微型月季和地被菊等4種組織培養(yǎng)苗,采用多菌靈和青霉素混合液浸泡處理,發(fā)現(xiàn)多菌靈能有效殺滅真菌,對細(xì)菌沒有明顯作用,而青霉素在初代培養(yǎng)時(shí)起抑制細(xì)菌的作用,然繼代后細(xì)菌污染照常存在,因此在初代培養(yǎng)時(shí)可把兩者混合使用,對培養(yǎng)過程污染的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。本研究中,月季組織培養(yǎng)材料來自于帶芽莖段,采取數(shù)量有限,因此在實(shí)驗(yàn)中借鑒李穎等的做法,將受污染的月季莖段或叢生芽取出,置于多菌靈3g和青霉素40萬單位的100mL混合液中,浸泡3min后,用無菌水沖洗3遍接種培養(yǎng)。連續(xù)觀察15d,月季的芽生長勢良好,未發(fā)生污染,結(jié)果與李穎等研究一致。3組織培養(yǎng)污染的原因(1)在18瓶污染物中分離鑒定出細(xì)菌5個(gè)屬9種,真菌6個(gè)屬26種;其中的腸桿菌屬、棒桿菌屬細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的66.7%;地霉屬、曲霉屬、毛霉屬、根霉屬的真菌占真菌總數(shù)的88.5%,它們是月季組織培養(yǎng)過程中引起污染的主要微生物菌類,因此是月季組織培養(yǎng)過程污染防止的重點(diǎn)對象。(2)從各種菌類所處的培養(yǎng)階段看,出現(xiàn)的細(xì)菌與真菌種類以增殖階段時(shí)數(shù)量與種類最多,誘導(dǎo)培養(yǎng)階段次之,在生根階段較少,但也不乏有7個(gè)屬的30個(gè)種類的細(xì)菌與真菌出現(xiàn),表明污染在組織培養(yǎng)的每個(gè)培養(yǎng)階段中都會發(fā)生。(3)從組織培養(yǎng)過程產(chǎn)生污染的培養(yǎng)瓶數(shù)量來看,在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段污染的量較大,這與外植體消毒不徹底有很大關(guān)系,另外無菌意識不強(qiáng)、無菌操作技術(shù)不熟練也是一個(gè)重要因素;在繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)時(shí),污染率明顯下降,但也出現(xiàn)了在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物時(shí),環(huán)境中的雜菌帶入培養(yǎng)瓶內(nèi),造成新污染的現(xiàn)象,因此注重?zé)o菌操作的訓(xùn)練,提高操作水平是降低污染率的重要手段。(4)控制或降低污染率是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù),同時(shí)也是組織培養(yǎng)工作效率高低的重要指標(biāo)之一。為了實(shí)現(xiàn)低污染率,在組織培養(yǎng)中除了采用常規(guī)的技術(shù)措施之外,還在培養(yǎng)基中有針對性地加入抑菌劑(如抗菌素)。韓美麗等在綠巨人組織培養(yǎng)中研究了青霉素鈉、先鋒霉素和慶大霉素對繼代培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑制效果,指出先鋒霉素抑菌最好,青霉素和慶大霉素次之;翟建中等研究發(fā)現(xiàn)鏈霉素能防除長春蔓芽繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)的細(xì)菌。但有報(bào)道在多數(shù)情況下使用抗菌素只能抑制細(xì)菌的生長而不能殺死它,濃度太高對植物有一定毒害作用,而且抗菌素一般不穩(wěn)定、遇酸堿或加熱易分解而失去活性,這些問題的存在使得抗菌素的使用受到一些限制。因此,尋找理想的抗菌素成為控制污染的一個(gè)重要課題。本研究在月季的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中將受污染程度較