鐵皮石斛組培快繁技術(shù)研究

鐵皮石斛組培快繁技術(shù)研究

西林石斛是多年生蕨類植物，也被稱為黑節(jié)草。這是一種珍貴的藥物，以其表皮為綠色而聞名。自古以來鐵皮石斛就被認(rèn)為是滋陰補(bǔ)益的珍品。唐開元年間道家經(jīng)典著作《道藏》中將其列為中華九大仙草之首。在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《現(xiàn)代中藥大辭典》中均有記載,《中華人民共和國藥典》2010年版將鐵皮石斛從石斛中分出作為單一品種收載。近幾年來,鐵皮石斛在用于癌癥放療、化療后的副作用消除和體能恢復(fù)等臨床效果顯著。鐵皮石斛生長在高山峻嶺懸崖峭壁和巖石縫隙或深山古樹上,在野生狀態(tài)下,繁殖速率低下、生長緩慢。鐵皮石斛資源緊缺、用量大,加之其具有極高的藥用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值,已被列為國家重點(diǎn)二級(jí)保護(hù)植物。為了保護(hù)這一珍貴的野生蘭科植物資源,需要擴(kuò)大鐵皮石斛人工種植的規(guī)模。本文結(jié)合鐵皮石斛的生物學(xué)特性,利用組織培養(yǎng)技術(shù),開展研究鐵皮石斛組培快繁技術(shù),以期為鐵皮石斛的大規(guī)模人工種植提供技術(shù)支撐。1材料和方法1.1材料表面1.1.1竹材的栽培品種本實(shí)驗(yàn)用的鐵皮石斛采自湖南省新寧峎山上,采回后栽種在湖南省長沙縣實(shí)驗(yàn)園地。采回的鐵皮石斛由河南信陽師范學(xué)院植物研究所鑒定為野生鐵皮石斛。1.1.2材料、設(shè)備和測試設(shè)備MS培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog固體培養(yǎng)基):上海艾研生物科技有限公司生產(chǎn);BA(6-芐基腺嘌呤):上海銳聰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;I-BA(吲哚丁酸):研域化學(xué)試劑有限公司;NAA(萘乙酸):上海銳聰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;香蕉汁:自制。1.2方法1.2.1活化、滅菌在園地栽種的石斛叢株上剪取其生長1年以上的莖,去掉葉,去掉灰塵,在無菌操作臺(tái)上用75%乙醇消毒30s后再用0.1%HgCl2浸泡滅菌15min,用無菌水沖洗3次,如此重復(fù)進(jìn)行3次滅菌。滅菌過程中輕輕攪拌莖段使滅菌更加徹底。1.2.2培養(yǎng)基的制備外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS為基本培養(yǎng)基,以及不同濃度的BA和IBA;原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L;原球莖分化培養(yǎng)基:MS為基本培養(yǎng)基,以及不同濃度的BA、NAA和香蕉汁;生根壯苗培養(yǎng)基:處理組1:MS+NAA0.2mg/L+香蕉汁20%,處理組2:分階段補(bǔ)加:(1)MS+NAA0.15mg/l+香蕉汁5%;(2)MS+NAA0.20mg/L+香蕉汁7.5%;(3)MS+NAA0.25mg/L+香蕉汁10%mg/L。培養(yǎng)基用0.1mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH5.8,121℃0.1MPa下高壓滅菌20min。1.2.3實(shí)驗(yàn)用ba和i-ba進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)以鐵皮石斛莖段為外植體,將已滅菌的外植體接種于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)中采取不同濃度的BA和I-BA進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。挑選長勢均一、生長狀態(tài)好、無分化、顏色嫩綠的原球莖進(jìn)行繼代培養(yǎng),繼代控制在8~10代。觀察7個(gè)不同濃度BA和IBA組對原球莖的誘導(dǎo)率。1.2.4ba、naa、香蕉汁組對原球莖分化的影響將大小一致的原球莖團(tuán)接種到分化培養(yǎng)基中,進(jìn)行再分化培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)考察5個(gè)不同濃度的BA、NAA和香蕉汁組對原球莖分化的影響,每組實(shí)驗(yàn)接種的總原球莖團(tuán)數(shù)為30、60d時(shí)觀察并統(tǒng)計(jì)其原球莖再分化出芽的數(shù)據(jù)。1.2.5分組補(bǔ)加培養(yǎng)待分化的鐵皮石斛長到約2cm高時(shí),轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)中,比較了兩種培養(yǎng)方法:分組1(對照組)直接轉(zhuǎn)接到處理組1的培養(yǎng)基上;分組2(實(shí)驗(yàn)組)采取分階段補(bǔ)加技術(shù),先用培養(yǎng)基(1)使苗快速長高,待小苗長到3~4節(jié),3~5cm高時(shí),再加入培養(yǎng)基(2)培養(yǎng)成中植株,最后接種在培養(yǎng)基(3)培養(yǎng)成大植株。每組200瓶苗,觀察不同營養(yǎng)液添加方法對鐵皮石斛生根長度、生根數(shù)及生根率的影響。1.2.6人工光照對鐵皮石斛苗生長的影響實(shí)驗(yàn)選取處于生根壯苗階段長勢均一、生長狀態(tài)好的瓶苗分為兩組,對照組(白熾燈組)和實(shí)驗(yàn)組(特定光譜節(jié)能燈組),每組100瓶苗。生長1個(gè)月后測量鐵皮石斛苗的鮮重、蘗芽數(shù)、株高以及莖粗,觀察不同人工光源對組培苗生長的影響。培養(yǎng)室溫度控制在(25±1)℃,光照強(qiáng)度為1500~2000Lux,光照12h/d。1.2.7水培育苗、放養(yǎng)常規(guī)的煉苗方法是是將試管苗移至煉苗房進(jìn)行煉苗,讓試管苗逐漸適應(yīng)自然環(huán)境,而我們采用水培馴化的方法進(jìn)行煉苗。實(shí)驗(yàn)選取長勢均一、生長狀態(tài)好的可以出苗的瓶苗分為3組:不煉苗組、常規(guī)煉苗組和水培馴化煉苗組,每組200瓶苗。不煉苗組處理方法:用鑷子將組培苗取出,放入清水盆中小心洗盡根部瓊脂,晾干后直接移栽到大田。常規(guī)煉苗組處理方法:將組培苗從培養(yǎng)室取出,放在室外遮蔭棚強(qiáng)光閉瓶煉苗10~20d,遮蔭度為50%~70%,然后打開瓶口再放置5~7d。準(zhǔn)備育苗盤,育苗盤中放置已消毒的基質(zhì)(碎石子和鋸木屑),噴水使基質(zhì)剛好浸透,將組培苗從瓶中取出洗盡移栽至育苗盤,最后將育苗盤擺入馴化室中正常管理。水培馴化煉苗組處理方法:準(zhǔn)備營養(yǎng)液槽,將打好小孔(φ5mm)的泡沫板(厚5mm)架于營養(yǎng)液槽上;將鐵皮石斛組培苗取出用15~20℃的清水沖洗,瀝去多余水分,栽種于泡沫浮板的孔隙中,將營養(yǎng)液注入營養(yǎng)液槽中,使?fàn)I養(yǎng)液浸沒根系,開動(dòng)營養(yǎng)液槽的循環(huán)水泵,流速5m/s;控制好光照(5000~10000Lux)、溫度(15~28℃)、相對濕度(80%~90%),每天噴霧3次,微量通風(fēng),進(jìn)行種苗煉化。觀察指標(biāo)為:鐵皮石斛種苗根系發(fā)達(dá),再生根增多,莖增粗,葉片變綠,變厚,即可以拔出進(jìn)行大田移栽。水培馴化煉苗營養(yǎng)液配方:硝酸鉀1g、硫酸銨0.2g、硝酸銨0.1g、硫酸鎂0.11g、磷酸二氫鉀0.1g、氯化鈣0.06g、硫酸錳0.02g、硫酸亞鐵0.03g、硫酸鋅0.005g、水1000mL。2結(jié)果與分析2.1ba和ip-1、mba濃度對原球莖誘導(dǎo)的效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,鐵皮石斛種苗組培過程見圖1。分組的1組中沒有添加激素,沒有原球莖的產(chǎn)生,而添加了BA和IBA的誘導(dǎo)率顯著提高。當(dāng)BA濃度為2.5mg/L、IBA濃度為0.20mg/L時(shí)誘導(dǎo)出原球莖的莖段數(shù)最多,誘導(dǎo)率達(dá)83.3%;當(dāng)BA濃度4.0mg/L、IBA濃度為0.30mg/L時(shí)莖段受抑制,不出芽,最后死亡。說明原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中激素濃度應(yīng)控制在一定范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)條件為MS+BA2.5mg/L+I-BA0.2mg/L。2.2整地度、分化率原球莖進(jìn)行分化可形成叢生芽,在培養(yǎng)過程中均會(huì)出現(xiàn)一定程度的分化,但不同激素濃度配比對原球莖分化整齊度、分化率影響不一,一定濃度的香蕉泥也有利于原球莖的分化,且可提高分化率。不同濃度組合的BA和NAA及香蕉汁對原球莖分化結(jié)果如表2所示,三者配比使用,明顯促進(jìn)原球莖分化,優(yōu)選出最適于原球莖分化的激素濃度配比為BA1.5mg/L+NAAl.2mg/L+5%香蕉汁的MS培養(yǎng)基。2.3段補(bǔ)加技術(shù)對鐵皮石斛幼苗根誘導(dǎo)及生根的影響從表3可以看出,在生根壯苗階段,采取營養(yǎng)液分階段補(bǔ)加技術(shù)更有利于鐵皮石斛幼苗根誘導(dǎo)及生根,其誘導(dǎo)率達(dá)95%,且苗生長旺盛,根、莖生長健壯,還減少了因更換培養(yǎng)基可能對組培苗根系造成的損傷。2.4組培光對補(bǔ)光效果的影響采用人工光源在棚室內(nèi)直接給作物補(bǔ)光是促進(jìn)植物生長的有效途徑,而高效節(jié)能地對植物補(bǔ)光的理論依據(jù)主要是植物對光的選擇性吸收的理論。從表4可以看出,實(shí)驗(yàn)中采取組培特定光譜節(jié)能燈,不僅能很好的滿足組培苗光合作用的要求,而且又能減少光的耗損和光熱的排放,很好地響應(yīng)了節(jié)能減排的低碳號(hào)召。所以優(yōu)選組培特定光譜節(jié)能燈為照射光源。2.5煉苗的深度2表5結(jié)果表明,鐵皮石斛進(jìn)行水培馴化煉苗時(shí),根系浸沒深度在40%~60%之間效果最好,所以優(yōu)選這個(gè)深度進(jìn)行煉苗。而從表6可知,水培馴化煉苗較常規(guī)煉苗有一定的優(yōu)勢,煉苗效果好,移栽成活率高,從而降低種苗的成本,增加相應(yīng)種植的產(chǎn)量。3組培苗的光照利用技術(shù)培養(yǎng)原球莖的目的是繼代繁殖、保存種子、擴(kuò)大繁殖倍數(shù)。通過組織培養(yǎng)的方式可在短時(shí)間內(nèi)提供大量種苗,對于鐵皮石斛GAP種植具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究立足于鐵皮石斛種苗的工廠化生產(chǎn),采用莖節(jié)為誘導(dǎo)對象,在常規(guī)組培繁殖技術(shù)上采用了組培特定光譜節(jié)能燈技術(shù),利用組培苗光合作用所需的特定光譜進(jìn)行光照,促進(jìn)組培苗光合作用,同時(shí)減少了非光合作用所需光波量而達(dá)到降低能耗和減少熱能產(chǎn)生的效果;采用了培養(yǎng)營養(yǎng)液分階段補(bǔ)加新技術(shù),保證了在生根生長過程中給鐵皮石斛組培苗提供足夠的營養(yǎng)成分時(shí),不因更換培養(yǎng)基而造成組培苗的根系損傷;采用了水培馴化煉苗技術(shù),能使種苗快速適應(yīng)非培養(yǎng)環(huán)境,并快速生長、增粗、生根、變綠;通過以上技術(shù)的應(yīng)用,縮短了種苗組培育苗周期,解決了從組培苗到大田栽培的技術(shù),使組培苗移栽成活率達(dá)98%,種苗的成本降低,種植的產(chǎn)量相應(yīng)增加。鐵皮石斛組培快繁技術(shù)在生產(chǎn)上的優(yōu)化,成功為蘭科植物種質(zhì)