單克隆抗體技術(shù)的原理、發(fā)展與主要制備過程

文獻(xiàn)綜述一單克隆抗體技術(shù)的原理、發(fā)展與主要制備過程摘要:通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備單克隆抗體藥物，已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域的一個重要方面，加上單細(xì)胞克隆在臨床和診斷上的巨大作用，單克隆抗體技術(shù)已經(jīng)是現(xiàn)在生物領(lǐng)域研究的重要組成部分。此文就單抗隆技術(shù)的原理、發(fā)展和研究方向等進(jìn)行了綜述,并對其存在的不足作了概述。關(guān)鍵詞：單克隆抗體應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞Abstract:Throughthelymphocytehybridomatechnologyorgeneticengineeringtechnologyofpreparationofmonoclonalantibodydrug,hasbecomeanimportantaspectinthefieldofbiologicalpharmacy,andsinglecellcloninginclinicaldiagnosisandtheenormousfunction,monoclonalantibodytechnologyisnowanimportantpartofthebiologicalfieldofresearch.Thisistheprincipleofsinglelungresistancetechnology,developmentandresearchdirectionweresummarized,anditsshortcomingsofoverview.Keywords:monoclonalAntibodiesApplicationHybridoma單克隆抗體原理抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成。每個B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成該細(xì)胞的子孫，即克隆由許多個被激活B細(xì)胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一個制造一種專一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進(jìn)行無限分裂；而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代，但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性。單克隆抗體的發(fā)展1975年，英國的科學(xué)家Kohler和Milstein合作將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)形成的雜交細(xì)胞既能在體外無限增殖，又能持續(xù)的分泌特異性的抗體，通過克隆化的培養(yǎng)可獲得純的細(xì)胞可以產(chǎn)生單克隆抗體。因此在1984年獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。在單克隆技術(shù)出現(xiàn)之后，許多研究者發(fā)現(xiàn)了這一技術(shù)的前景，紛紛投入到這一領(lǐng)域的研究。該技術(shù)也飛速的發(fā)展起來，到二十世紀(jì)八十年代中期，單克隆技術(shù)已日臻完善，開始廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和生物技術(shù)的各個領(lǐng)域，以及臨床診斷和治療的許多領(lǐng)域。特別是在2000年后，人類基因組草圖繪制的完成，生命科學(xué)的發(fā)展將進(jìn)入后基因組時代?？梢钥隙ǖ氖牵谖磥淼囊欢螘r間，人們對各種單克隆抗體的的需求會有一個很大的增長，繼而，單克隆技術(shù)會有一個很大的發(fā)展。2.1.單克隆抗體的應(yīng)用2.1.1.作為親合層析的配體單克隆抗體能與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，因而能夠從復(fù)雜系統(tǒng)中識別出單個成分。只要得到針對某一成分的單克隆抗體，利用它作為配體，固定在層析柱上，通過親合層析，即可從復(fù)雜的混和物中分離、純化這一特定成分。2.1.2作為生物治療的導(dǎo)向武器質(zhì)體是由既親水又親油的兩親磷脂組成的連續(xù)雙分子層微囊，內(nèi)含水相空間，可包裹水溶性物質(zhì)。包有細(xì)胞毒劑的脂質(zhì)體膜上偶聯(lián)抗體，可定向攻擊靶細(xì)胞，稱為免疫脂質(zhì)體。這種“導(dǎo)向治療”，在動物試驗與體外試驗中已獲得滿意效果。2.1.3.作為免疫抑制劑抗人T淋巴細(xì)胞單抗(McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)。其作用機(jī)理有賴于McAb的種類及其免疫學(xué)特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應(yīng)。2.1.4作為研究工作中的探針單克隆抗體只與抗原分子上某一個表位(即抗原決定簇)相結(jié)合，利用這一特性就可把它作為研究工作中的探針。此時，可以從分子、細(xì)胞和器官的不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，進(jìn)而并可從理論上闡明其機(jī)理。如用熒光物質(zhì)標(biāo)記單抗作為探針，能方便地確定與其結(jié)合的相應(yīng)生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶等)在細(xì)胞中的位置和分布。2.1.5增強(qiáng)抗原的免疫原性1984年以來，Celis等發(fā)現(xiàn)，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增強(qiáng)HBs抗原對特異性人T細(xì)胞克隆的刺激增殖，并可誘生干擾素。在小鼠中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蛣┝康腍Bs抗原不產(chǎn)生免疫反應(yīng)時，加入抗HBs抗體組成的復(fù)合物，則可有效地誘生免疫反應(yīng)。根據(jù)這一作用，現(xiàn)已研制出乙肝的抗原一抗體復(fù)合物型治療性疫苗。2.1.6作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑單克隆抗體作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑，更能充分發(fā)揮其優(yōu)勢。單克隆抗體的特異性強(qiáng)，大大提高了抗原一抗體反應(yīng)的特異性，減少了和其它物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性，使試驗結(jié)果可信度更大。單抗的均一性和生物活性的單一性，使抗原一抗體區(qū)應(yīng)結(jié)果便于控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。目前已有許多檢驗試劑盒用單抗制成，其主要用途如下：⑴診斷各類病原體這是單抗應(yīng)用最多的領(lǐng)域，已有大量診斷試劑商品供選擇。如用于診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒和各種微生物、寄生蟲感染的試劑等。單抗所具有的靈敏度高、特異性好的特點，使其在鑒別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具獨特優(yōu)勢。⑵腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的檢測用于腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單抗，但對腫瘤相關(guān)抗原（如甲胎蛋白、腫瘤堿性蛋白和癌胚抗原）的單抗早就用于臨床檢驗。隨著淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用，許多抗人腫瘤標(biāo)記物的雜交瘤細(xì)胞株已經(jīng)建立，這為腫瘤的早期診斷及其闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性及其定量研究奠定了基礎(chǔ)。用抗腫瘤單抗檢查病理標(biāo)本，可協(xié)助確定轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位。以放射性核素標(biāo)記單抗可用于體內(nèi)診斷，再結(jié)合X-線斷層掃描技術(shù)，可對腫瘤的大小及其轉(zhuǎn)移灶作出定量診斷。⑶檢測淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志用于區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞的分化階段。例如檢測CD系列標(biāo)志，有利于了解細(xì)胞的分化和T細(xì)胞亞群的數(shù)量和質(zhì)量變化，這對多種疾病診斷具有參考意義。細(xì)胞表面抗原的檢測，將對白血病患者的疾病分期、治療效果、預(yù)后判斷等方面有指導(dǎo)作用。組織相容性抗原檢測是移植免疫學(xué)的重要內(nèi)容，應(yīng)用單抗對其進(jìn)行位點檢測可得到更可信的結(jié)果。⑷機(jī)體微量成分的測定應(yīng)用單抗結(jié)合其它技術(shù)，可對機(jī)體的多種微量成分進(jìn)行測定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的靈敏性和抗原-抗體反應(yīng)的特異性而建立起來的方法，它可以測至10-9?10-12g，使原來難以測定的激素能夠進(jìn)行定量分析。除了激素，還可檢測諸多酶類、維生素、藥物和其它生化物質(zhì)。這對受檢者健康狀態(tài)判斷、疾病檢出、指導(dǎo)診斷和臨床治療均具有實際意義。2.2單克隆抗體技術(shù)的研究方向1） 新一代單克隆抗體、疫苗類藥物最新進(jìn)展與前景展望；2） 新一代單克隆抗體、疫苗類藥物的國際、國內(nèi)市場狀況；3） 新一代單克隆抗體、疫苗類藥物生產(chǎn)的新工藝和新技術(shù)：包括上游表達(dá)技術(shù)、細(xì)胞培樣技術(shù)、抗體嵌合技術(shù)、抗體人源化技術(shù)、下游純化技術(shù)、單抗及疫苗類藥物新的制劑方法等；新一代單克隆抗體、疫苗類藥物的產(chǎn)業(yè)化配套技術(shù)檢測手段，病毒、骯病毒滅活，工藝認(rèn)證等；與單克隆抗體檢測試劑有關(guān)的新技術(shù)：如抗體的篩選、試紙的制造等；疫苗研究的最新進(jìn)展。不僅如此，“單克隆抗體技術(shù)與基因克隆技術(shù)相結(jié)合更將為分離和鑒定新的蛋白質(zhì)和基因開辟一條寬闊途徑”。2.3單克隆抗體存在的問題腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一些閉性抗體，把自己保護(hù)住，使單克隆抗體所攜的藥物不能很好的發(fā)揮作用。人類對單克隆抗體的技術(shù)還并不那么得心應(yīng)于，僅僅是剛剛起步。單克隆缸體的產(chǎn)物是從具有腫瘤細(xì)胞表型特征的細(xì)胞而來，來自這種細(xì)胞的產(chǎn)物是否存在生物毒害作用，特別是可能釋放致癌病毒。單克隆抗體可能誘發(fā)個體型反應(yīng)，而從抗體對其靶抗原角度看，這可能造成單克隆抗體失活。反復(fù)注射單克隆抗體，可能造成對單克隆抗體的個體型免疫，并使單克隆抗體失去生物活力。單克隆抗體制備過程雜交瘤細(xì)胞的制備.提取合成專一性抗體的單個B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長。.應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞。這種細(xì)胞既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性.對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，選出所需要的細(xì)胞群，并進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)獲得單克隆抗體。單克隆抗體的提純一般常用金黃色葡萄球菌蛋白A一瓊脂糖4B親和層析法。單克隆抗體的保存由腹水中獲得的抗體，經(jīng)離心去除細(xì)胞成分，再經(jīng)冷凍超速離心，取上清液加0.1%NaN3，少量分裝，冷凍于-70°C可保存幾年。但應(yīng)避免反復(fù)凍融,否則抗體失活，特別是IgM抗體。提純的單克隆抗體，冷凍干燥保存于2?8C，取出時溶解后，保存于2?8C，至少一個月內(nèi)可保持穩(wěn)定。腹水抗體也可冷凍干燥低溫(4C)保存兩年，融化后放置4C下保存一個月。短期使用的腹水抗體，4C3?4個月仍保持穩(wěn)定，培養(yǎng)上清加0.1%NaN3，貯于-20C，兩年不失活性。參考文獻(xiàn)：汪永和.雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)及其分泌的單克隆抗體的純化[D].昆明醫(yī)學(xué)院,2004.何忠效.淺談單克隆抗體[J].生物學(xué)通報,2004,09:1-4.朱學(xué)泰，謝溱，馬瑞君.單克隆抗體制備技術(shù)研究進(jìn)展[J].甘肅科技，2005,03:108-109+98.孔君,劉箐,韓躍武,王天昌，劉金芝.單克隆抗體制備技術(shù)的最新進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].免疫學(xué)雜志,2011,02:170-173.郭粉粉，梁文波，張學(xué)梅.單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011,08:1129-1131.劉萍，陳苗苗，劉學(xué)榮，牟克斌，黃銀君.單克隆抗體