巴西橡膠樹(shù)膠乳中大小橡膠粒子的分離純化

巴西橡膠樹(shù)膠乳中大小橡膠粒子的分離純化

0橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞生物合成活性的變化自然界生產(chǎn)著2500多種橡膠植物。然而，只有巴西的橡膠樹(shù)才能生產(chǎn)大量高質(zhì)量的天然膠，這是世界上天然膠的主要來(lái)源。橡膠粒子是巴西橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中的一種特殊細(xì)胞器,是橡膠樹(shù)膠乳的主要成分,約占膠乳的30%~45%(v/v),其主要生物學(xué)功能是進(jìn)行橡膠生物合成。與其他植物細(xì)胞器相似,橡膠粒子可能起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),但也有研究表明橡膠粒子是在細(xì)胞質(zhì)中自由形成。最初形成的為小橡膠粒子(smallrubberparticle,SRP),呈電子致密的小球狀,直徑為40~60nm;隨著進(jìn)一步發(fā)育和體積增大,橡膠粒子的中央?yún)^(qū)成為電子透明狀態(tài)。成熟的橡膠粒子,又稱為大橡膠粒子(largerubberparticle,LRP),是由單層生物膜包被而成的電子透明梨形或圓形球體,最大直徑可達(dá)2μm,合成的橡膠分子儲(chǔ)藏在橡膠粒子中。橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中的橡膠粒子不僅大小差異較大,而且它們還具有不同的橡膠生物合成活性,即小橡膠粒子的橡膠生物合成速率明顯大于大橡膠粒子,表明大橡膠粒子中可能存在導(dǎo)致橡膠生物合成終止的生化機(jī)制。橡膠生物合成包括起始、延長(zhǎng)和終止3個(gè)連續(xù)而有序的過(guò)程。目前,關(guān)于橡膠生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)理尚不完全清楚。橡膠粒子膜組分中的酶和蛋白因子在催化和調(diào)控橡膠生物合成反應(yīng)中起著非常重要的作用。橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中的大小橡膠粒子在結(jié)構(gòu)和膜組成上表現(xiàn)出一定程度的差異,這種膜結(jié)構(gòu)和組分上的變化,可能與大橡膠粒子橡膠生物合成速率的下降直至橡膠生物合成的終止具有一定的相關(guān)性。最近,Sando等的研究證明,小橡膠粒子主要分布于橡膠樹(shù)韌皮組織的內(nèi)層乳管細(xì)胞,而外層乳管細(xì)胞則主要含有大橡膠粒子,并認(rèn)為大小橡膠粒子中都存在的高豐度表達(dá)蛋白橡膠延長(zhǎng)因子(rubberelongationfactor,REF)可能也是橡膠生物合成的終止因子。雖然已通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)橡膠樹(shù)橡膠粒子蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行了研究,但是迄今為止,還沒(méi)有報(bào)道過(guò)大小橡膠粒子的有效分離方法,更不清楚橡膠樹(shù)大小橡膠粒子之間的差異表達(dá)蛋白,而大小橡膠粒子蛋白質(zhì)表達(dá)模式的變化可能是它們具有不同的橡膠生物合成活性,并導(dǎo)致大橡膠粒子橡膠生物合成終止的重要原因。為此,筆者建立了從橡膠樹(shù)膠乳中分離出大小橡膠粒子的差速離心的方法,這將為鑒定大小橡膠粒子之間的差異表達(dá)蛋白,以期為進(jìn)一步研究橡膠生物合成的分子機(jī)制以及橡膠粒子的起源和發(fā)育提供參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)研究與試驗(yàn)設(shè)備研究田間試驗(yàn)于2010年10月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)4隊(duì)進(jìn)行,室內(nèi)試驗(yàn)于2010年11月—2011年9月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所進(jìn)行。1.2熱研7-33-97試驗(yàn)材料為種植在海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)4隊(duì)的巴西橡膠樹(shù)(HeveabrasiliensisMull.Arg.)無(wú)性系熱研7-33-97,割齡為3年,按1/2樹(shù)圍、3天1刀的常規(guī)割制割膠,未用乙烯利刺激。通過(guò)正常割膠,將割膠后5~30min內(nèi)排出的橡膠樹(shù)新鮮膠乳收集于冰浴中的干凈離心管內(nèi),帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行橡膠粒子的分離以及橡膠粒子蛋白的提取與純化。1.3測(cè)試方法1.3.1橡膠樹(shù)膠乳總橡膠粒子的分離將收集到的橡膠樹(shù)新鮮膠乳在4℃16000r/min條件下離心60min,收集位于離心管頂層的橡膠粒子部分,用5倍體積的等滲溶液(10mmol/LTris-HCl、250mmol/L蔗糖,pH7.0)充分懸浮并洗滌橡膠粒子3次,4℃16000r/min條件下離心15min,收集純凈的橡膠粒子,即為大小橡膠粒子尚未得到分離的橡膠樹(shù)膠乳總橡膠粒子。然后,采用12000~18000r/min差速離心的方法,分別從等滲溶液懸浮的總橡膠粒子中分離大橡膠粒子和小橡膠粒子。1.3.2橡膠粒子懸液的固定和干燥參照Singh等的方法并作改進(jìn)。取懸浮于等滲溶液中的橡膠粒子,加入等體積6%戊二醛溶液(用0.05mol/L二甲基砷酸鈉配制,含1%單寧酸),室溫下固定橡膠粒子2h,離心去除固定液,并用等滲溶液洗滌橡膠粒子3次,離心收集橡膠粒子,然后將橡膠粒子懸浮在1%鋨酸固定液中,室溫下固定1h,離心去除固定液,用純凈水洗滌橡膠粒子2次,離心收集橡膠粒子,最后將橡膠粒子充分懸浮在適當(dāng)體積的純凈水中。取1滴固定好的橡膠粒子懸浮液滴在干凈的錫箔紙上,室溫下干燥過(guò)夜。經(jīng)E-1010型噴鍍儀(Hitachi,Japan)真空噴金后,用S-3000N掃描電子顯微鏡(Hitachi,Japan)觀察固定好的橡膠粒子。1.3.3信大糖酸酯酶抑制劑單次給藥法roge-4h2o參照段翠芳等的方法并作改進(jìn)。將離心分離后的橡膠粒子轉(zhuǎn)移到5倍體積的蛋白提取液中,并使橡膠粒子充分懸浮,蛋白提取液為50mmol/LHepes-Tris緩沖液,pH7.5,其中含8mol/L尿素、2mol/L硫脲、5mmol/LEDTA-Na2·2H2O、10mmol/Lβ-巰基乙醇、60mmol/LDTT、0.5mmol/LPMSF、4%Chaps、1%NP-40和蛋白酶抑制劑(RocheAppliedScience),4℃下攪拌抽提30min后,在冰浴中超聲處理3min。將蛋白抽提液在4℃16000r/min離心60min,吸取下層清液,并在4℃24000r/min繼續(xù)離心90min,吸取下層清液。用ReadyPrep2-DECleanupKit(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化,收集橡膠粒子蛋白,并溶解在2×SDS樣品緩沖液中,-80℃條件下保存。1.3.4電泳條件及蛋白質(zhì)上樣量用常規(guī)SDS的方法對(duì)橡膠粒子蛋白進(jìn)行電泳分離,分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為4%,電泳條件為恒流25mA。蛋白質(zhì)上樣量為80μg。電泳結(jié)束后,將凝膠于適量體積的考馬斯亮藍(lán)R250染色液(50%乙醇,10%乙酸,1‰考馬斯亮藍(lán)R-250)室溫下染色2h,用脫色液(40%乙醇,10%乙酸)脫色2h,最后在3%乙酸中脫色3h。1.3.5rpp對(duì)橡膠顆粒蛋白質(zhì)的質(zhì)量分析和評(píng)價(jià)從SDS膠上切取小橡膠粒子蛋白泳道上與SRPP分子量對(duì)應(yīng)的蛋白帶,參照段翠芳等1.3.6轉(zhuǎn)移效果轉(zhuǎn)移橡膠粒子蛋白的Westernblotting分析參照Z(yǔ)eng等的方法。SDS結(jié)束后,用電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,麗春紅染色以檢測(cè)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效果。將印跡有蛋白的硝酸纖維素膜用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液(20mmol/LTris-HCl、150mmol/LNaCl、0.1%Tween20)室溫下封閉1h,然后在室溫下與橡膠粒子蛋白R(shí)EF的單克隆抗體(抗體與封閉液的體積比為1:1000)孵育1h,用TBST洗膜4次、每次l0min,將膜與辣根過(guò)氧化酶藕聯(lián)的羊抗小鼠IgG(抗體與封閉液的體積比為1:10000)室溫下孵育1h,用TBST洗膜4次、每次l0min,最后將膜放入顯色液中進(jìn)行蛋白帶的顯色反應(yīng)。2結(jié)果與分析2.1橡膠粒子的分離方法橡膠樹(shù)膠乳中存在著可引起橡膠粒子凝絮的物質(zhì),在離體條件下,膠乳中的橡膠粒子容易發(fā)生凝絮,從而導(dǎo)致橡膠粒子的凝固。因此,長(zhǎng)期以來(lái),橡膠樹(shù)膠乳大小橡膠粒子的分離方法都未得到有效地解決。根據(jù)橡膠粒子體積大小的不同而存在密度上的差異,本研究建立了使用不同離心力分離大小橡膠粒子的差速離心分離方法,其中在12000~18000r/min離心力范圍內(nèi),可以使膠乳中的大小橡膠粒子分別得到有效的分離。試驗(yàn)過(guò)程中,使用等滲溶液懸浮和洗滌橡膠粒子不僅可以充分去除污染的雜質(zhì),而且還可使橡膠粒子保持完好的形態(tài),橡膠粒子不會(huì)因?yàn)槎啻蜗礈旌透咚匐x心而破裂。為了鑒定到更多的與橡膠粒子結(jié)合的外周蛋白,洗滌橡膠粒子的等滲溶液選擇pH7.0的中性溶液,洗滌次數(shù)不宜超過(guò)3次。2.2橡膠顯微鏡表征為了檢測(cè)差速離心分離法分離純化大小橡膠粒子的效果,應(yīng)用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)純凈的橡膠粒子進(jìn)行觀察和比較。在未經(jīng)分離的橡膠樹(shù)膠乳橡膠粒子中,根據(jù)發(fā)育程度的不同,可明顯地區(qū)分為小橡膠粒子(SmallRubberParticle,SRP)和大橡膠粒子(LargeRubberParticle,LRP),以及體積大小介于這兩者之間的其他橡膠粒子(圖1A),這與用透射電子顯微鏡(TEM)觀察橡膠粒子的結(jié)果一致。通過(guò)差速離心法適當(dāng)調(diào)節(jié)離心力的大小,可將橡膠樹(shù)膠乳中的大橡膠粒子(圖1B)和小橡膠粒子(圖1C)有效分離出來(lái)。在試驗(yàn)過(guò)程中始終使用等滲溶液充分洗滌和懸浮橡膠粒子,一方面可使分離的橡膠粒子不易發(fā)生破裂而保持原狀,另一方面可最大程度地消除其他細(xì)胞組分和蛋白質(zhì)的污染。2.3橡膠樹(shù)大小橡膠粒子分子質(zhì)量分析分別從小橡膠粒子、大橡膠粒子和未經(jīng)分離的膠乳總橡膠粒子中提取橡膠粒子蛋白,并進(jìn)行SDS電泳分析。SDS電泳(圖2A)和Westernblotting檢測(cè)(圖2B)均證明,不管是小橡膠粒子、大橡膠粒子還是未經(jīng)分離的總橡膠粒子都具有幾乎等量表達(dá)橡膠延長(zhǎng)因子(REF)蛋白。REF是存在于橡膠粒子上的高豐度表達(dá)蛋白,因?yàn)樗诖笮∠鹉z粒子上的表達(dá)沒(méi)有差異,因此,REF可以作為研究橡膠粒子的起源和發(fā)育的標(biāo)記分子。此外,電泳結(jié)果證明,橡膠樹(shù)大小橡膠粒子的蛋白譜帶之間表現(xiàn)出一定程度的差異,尤其是分子量約為24.5kDa的小橡膠粒子蛋白SRPP(SmallRubberParticleProtein)只存在于小橡膠粒子和未經(jīng)分離的總橡膠粒子中,而在大橡膠粒子中幾乎不存在SRPP,這與SRPP是小橡膠粒子的特異表達(dá)蛋白相符,進(jìn)一步對(duì)此蛋白帶進(jìn)行了質(zhì)譜分析與鑒定,其中SRPP的1個(gè)水解片段的MS/MS質(zhì)譜圖如圖3A所示,經(jīng)質(zhì)譜分析,該片段所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為IVLDVASSVFNTGVQEGAK,位于SRPP蛋白質(zhì)(GI:14423933)序列的第106~124位氨基酸殘基之間(見(jiàn)圖3B)。除了差異表達(dá)蛋白SRPP外,SDS電泳結(jié)果還表明,大小橡膠粒子在分子量約為22kDa、35kDa、50kDa、80kDa以及120kDa等蛋白的表達(dá)上也存在量的差異,這些差異表達(dá)蛋白的性質(zhì)及其生物學(xué)功能現(xiàn)在尚未得到鑒定。從SRPP和REF在大小橡膠粒子上的表達(dá)特征可以推測(cè),REF可能并不是橡膠粒子中催化橡膠生物合成的關(guān)鍵蛋白因子,而只在小橡膠粒子上表達(dá)的SRPP則可能與大小橡膠粒子具有顯著不同的橡膠生物合成速率密切相關(guān),然而,目前對(duì)SRPP的生物學(xué)功能還未完全確定。3結(jié)論和討論3.1橡膠粒子的生物活性筆者建立的差速離心法,分離純化橡膠樹(shù)膠乳中的大小橡膠粒子,具有步驟簡(jiǎn)單和操作便利等特點(diǎn),克服了用分子篩等其他方法分離純化大小橡膠粒子時(shí)容易發(fā)生橡膠粒子的凝絮、凝固等缺點(diǎn);試驗(yàn)過(guò)程中,始終用等滲溶液懸浮和洗滌橡膠粒子,可避免橡膠粒子因滲透壓的改變而導(dǎo)致破裂,從而可以得到完整并具有生物活性的大小橡膠粒子,可進(jìn)一步用于橡膠粒子的離體橡膠生物合成,以及橡膠粒子蛋白的生物學(xué)功能鑒定等研究。洗滌橡膠粒子所用等滲溶液的pH以及洗滌次數(shù),對(duì)橡膠粒子的生理活性具有較大的影響。除了橡膠粒子的跨膜蛋白外,與橡膠粒子結(jié)合的外周蛋白質(zhì)對(duì)維持橡膠粒子的正常生理功能也具有重要作用。因此,宜用pH7.0的中性溶液洗滌和懸浮橡膠粒子,洗滌次數(shù)不宜過(guò)多,3次洗滌即可去除大部分污染的膠乳C-乳清蛋白,并可用于大小橡膠粒子的差異表達(dá)蛋白分析。3.2橡膠樹(shù)不同部位菌群差異表達(dá)蛋白橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中的橡膠粒子經(jīng)歷了從最初形成的小橡膠粒子至最終變成為大橡膠粒子的發(fā)育過(guò)程。大橡膠粒子不僅體積不再增大,且橡膠生物合成也已終止。迄今為止,關(guān)于橡膠生物合成的起始和終止等橡膠生物合成的分子機(jī)制尚不完全清楚。橡膠生物合成是在橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中的橡膠粒子上進(jìn)行,許多橡膠粒子蛋白,如REF、SRPP和橡膠轉(zhuǎn)移酶等是橡膠生物合成的關(guān)鍵酶或蛋白因子,它們的表達(dá)與變化不僅影響橡膠生物合成,而且還與橡膠樹(shù)的膠乳產(chǎn)量密切相關(guān)。SRPP是目前已知的小橡膠粒子特異表達(dá)蛋白,并被認(rèn)為在橡膠生物合成中發(fā)揮重要作用。筆者的結(jié)果表明,除SRPP外,橡膠樹(shù)大小橡膠粒子之間