煙草花葉病毒的誘變選育及交互保護作用研究

煙草花葉病毒的誘變選育及交互保護作用研究

由于松茸（tv）引起的卷煙花葉病是卷煙生產中最重要的疾病之一。利用弱勢植物保護寄生蟲避免感染同類型病毒的側支是當前國內外病毒防治的熱點之一。對于弱毒植物的獲取方法很多。除了自然過濾外，還可以通過物理因素（如輻射、熱處理）和化學因素（如亞硝酸）對強毒植物進行人工誘導。由于mtv的自然武變率低，難以獲得弱毒植物，因此采用人工武變法可以快速實現突變目標。因此，mtv弱毒植物通常采用人工誘導和轉化方法。在本實驗中，通過處理、亞硝酸鹽誘導和混合處理，對vmv強毒株進行誘導和篩選，并分析影響相互作用保護的因素。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1病毒毒源采自福建龍巖煙區(qū)的典型煙草花葉病株,經心葉煙連續(xù)4次單斑分離后,繁殖在普通煙上.1.1.2煙臺草品種為普通煙品種(K326),由福建省大田縣煙草公司提供.1.1.3抗血小板聚集抗血清TMV普通株系的抗血清由福建農林大學植物病毒研究所制備,用瓊脂雙擴散法測定其效價為1∶100.1.1.4種子和消毒供試鑒別寄主植物種子部分由廈門華僑亞熱帶引種植物園徐平東博士贈送,部分購自市場或采自野外.所有種子均用質量濃度為0.1g·mL-1Na3PO4消毒后使用.1.2強制改變方法1.2.1病汁液接種方法以分離純化的TMV強毒株為材料,參照後藤忠則ら的方法,35℃熱處理15-16d.以K3PO4緩沖液(1/15mol·L-1,pH7.2)100倍稀釋(W/V)的病汁液接種心葉煙為對照.1.2.2硝酸處理參照鄭貴彬等的方法,處理10-40min.1.2.3綜合處理取35℃熱處理15d的莖部,再經上述亞硝酸處理.1.3elisa法檢測多態(tài)性煙株中的毒株和毒株記錄小型單斑數和總斑數.單斑分離參照Yehetal的方法,1個單斑接種1株普通煙.觀察20d,淘汰有表現癥狀的煙株,無癥狀的煙株用間接ELISA法檢測.陽性反應的植株接種心葉煙復檢,陰性反應的植株接種強毒株.1.4虛弱毒癥的篩選1.4.1中毒的評估將經間接ELISA法檢測確定為帶毒但不表現癥狀的病株接種于心葉煙,單斑分離后接種普通煙,并觀察其癥狀表現,以同樣方法連續(xù)接種4代.1.4.2接種葉和系統(tǒng)葉參考覃秉益等方法,稍作修改.接種弱毒株時,第1次接種后隔10min左右重接1次.接種14d后用間接ELISA法檢測植物的接種葉和系統(tǒng)葉,檢測為陽性的植株繼續(xù)觀察癥狀的表現.1.5接種前和接種后取樣強、弱毒株分別接種團棵期普通煙的第4葉位葉片,各重復3株.弱毒株接種方法同1.4.2.分別于接種前及接種1d后開始取樣.接種部位包括接種葉和接種葉的上3位葉.取樣方法:用直徑為8mm的打孔器在重復的3株上各取1圓片,將3個圓片合在一起稱重,按1∶10(W/V)加入包被緩沖液,-20℃保存,最后用間接ELISA法檢測.1.6強、弱毒株增殖速率的測定采用正交設計法,以L9(34)方案安排試驗,每組重復10株.考察因素包括弱、強毒株接種濃度,接種間隔時間,強毒株的接種部位及煙株生育期等.強、弱毒株的病葉分別用K3PO4緩沖液(0.1mol·L-1,pH7.2)100倍稀釋(W/V),接種心葉煙,測定枯斑數,確定強、弱毒株的接種濃度.取強毒株濃度高于弱毒株濃度,強、弱毒株濃度相同及強毒株濃度低于弱毒株濃度3個位級.煙株生育期分為幼苗期、團棵期及成熟期.根據強、弱毒株增殖速率的測定結果,確定弱、強毒株的接種間隔時間,取弱毒株處于潛伏期、弱毒株增殖并輸送到系統(tǒng)葉上及弱毒株在煙草植株中充分擴展這3個時間段.強毒株接種部位分別為弱毒株接種葉的上位葉、接種葉及下位葉.觀察癥狀,接種強毒株30d后記錄結果,統(tǒng)計病株率.2結果與分析2.1小型枯斑的誘變效果TMV的強毒株與弱毒株在心葉煙上可出現2種不完全相同的枯斑,前者為大型淡色枯斑,后者為小型枯斑,故以小型枯斑作為突變成弱毒株的標志,誘變結果見表1.未經誘變劑處理的N1/N2值為0.803;而35℃熱處理、亞硝酸處理及復合處理的N1/N2值都有所提高,說明3種誘變處理都可以有效提高突變頻率;而復合處理的N1/N2值與對照相比提高顯著,較單獨處理也有明顯的提高,說明復合處理具有較好的協(xié)同效應.2.2虛弱毒癥的篩選2.2.1帶毒煙草植株的篩選單斑分離共接種了258株煙苗,20d后淘汰37株有表現癥狀的煙苗.用間接ELISA法檢測不表現癥狀的煙苗,其中17株為陽性反應,15株陸續(xù)出現癥狀,只有代號為017、022的2個突變株表現相當穩(wěn)定,即不表現癥狀.以間接ELISA法檢測為陰性的煙苗接種強毒株,發(fā)現有1株連續(xù)2次均不表現癥狀,將其接種于心葉煙,有枯斑產生,其標號為152.選定標號為017、022、152的3個變異株進行毒力鑒定.連續(xù)反復接種心葉煙及普通煙4次,觀察普通煙表現的癥狀,結果見表2.017和152連續(xù)4代在普通煙上均不表現癥狀,表明這2株的弱毒性穩(wěn)定.而022的4代剛開始時均不表現癥狀,到后期(至少接種30d后)出現輕微花葉癥狀,表明其弱毒性不穩(wěn)定.從而獲得2株穩(wěn)定的弱毒株,記為TMV-017(35℃熱處理15d)及TMV-152(復合處理20min).2個突變株的帶毒煙草植株與正常植株外觀上無顯著區(qū)別.因此熱處理和復合處理均獲得了穩(wěn)定的弱毒株.2.2.2供試植物的篩選強、弱毒株共接種17科50種植物,包括茄科的辣椒、普通煙、白肋煙、心葉煙、三生煙、洋酸漿、番茄、龍葵、枯斑三生煙、蔓陀蘿,豆科的綠豆、豌豆、花生、蠶豆、大豆、赤豆、豇豆、菜豆、菜豆(pinto),十字花科的白蘿卜、包菜、花椰菜、青菜、芥菜、油菜,葫蘆科的苦瓜、絞股藍、絲瓜、甜瓜、黃瓜,車前科的大車前,菊科的蒼耳、萵苣、馬蘭、野菊花,藜科的莧色藜,莧科的千日紅、莧菜,紫茉莉科的紫茉莉,禾本科的玉米,旋花科的空心菜、甘薯、裂葉牽牛,鳳仙花科的鳳仙花,傘形科的芹菜,番木瓜科的番木瓜,商陸科的商陸,唇形科的紫蘇,夾竹桃科的長春花.接種后的癥狀觀察和間接ELISA法檢測表明:在供試植物中,強、弱毒株主要侵染4科13種植物,在心葉煙、曼陀羅、枯斑三生煙、菜豆(pinto)、莧色藜、千日紅的接種葉上均為局部壞死斑.強毒株在辣椒、普通煙、洋酸漿、三生煙、龍葵、白肋煙、番茄上為系統(tǒng)侵染,呈花葉癥狀,而TMV-017和TMV-152能侵染,但沒有可見的癥狀.表明篩選得到的弱毒株并未擴大寄主范圍,弱毒株的應用在這些植物上是安全的.2.3穩(wěn)定性檢測所用弱毒株為TMV-152.在接種葉上強毒株的陰性對照D(405nm)值為0.113,弱毒株TMV-152的陰性對照D(405nm)值為0.186(表3).采用ELISA方法檢測病毒時,D(405nm)值/陰性D(405nm)值≥2,則判定檢測結果為陽性.由表3可知:強毒株在接種后第2天該比值為4.894,而弱毒株在接種后第4天該比值為3.699,故為陽性反應,表明強毒株的增殖速率比弱毒株快.強毒株的比值穩(wěn)定在8左右,而弱毒株的比值則遠低于8,表明強毒株在煙草植株體內的濃度比弱毒株的高.在系統(tǒng)葉上,強毒株的陰性D(405)值為0.111,弱毒株(TMV-152)的陰性D(405nm)值為0.185(表4).由表3可知,強毒株在接種后第4天比值達到3.694,而弱毒株則在第5天達到2.222,故為陽性反應,表明強、弱毒株均已擴展到系統(tǒng)葉上.從接種葉和系統(tǒng)葉上的增殖速率看,弱毒株在煙草植株體內的運輸并未受到影響.2.4團株期和接種間隔時間所用弱毒株為TMV-152.強、弱毒株分別接種心葉煙,枯斑數相差3倍,因而確定弱、強毒株接種濃度分(1/10,1/10)、(1/10,1/40)、(1/10,1/160)3個位級.弱、強毒株接種間隔時間分別取1、6、17d3個位級,4個因素的3個位級見表5.用L9(34)正交表安排試驗,結果見表6.從表7可知,考察的4個因素中,強、弱毒株接種間隔時間的極差(R)最大,表明它們是影響弱毒株保護作用的最重要因素.在團棵期,弱、強毒株接種間隔時間為17d,保護效果最佳(病株率為0).3討論3.1tmv弱毒株的獲得植物病毒的變異機制有許多種,但自然突變率通常很低.一般而言,采用自然分離的方法也可以獲得弱毒株,但并非對所有的病毒都適用.采用人工誘變處理,可大大提高突變頻率,從而獲得理想的弱毒株.人工誘變方法很多,可根據誘變劑的作用機理加以選擇.在誘變育種中,經常應用復合處理的協(xié)同效應.在獲得TMV弱毒株的方法上,前人大多采用單種誘變處理.Holmes通過熱處理獲得弱毒株TMV-M;日本大島通過熱處理TMV,在番茄上經4代繁殖得到L11A弱毒株,并已在日本大規(guī)模推廣應用,保護番茄免受TMV強毒株的危害,獲得增產15%-30%的保護效果;荷蘭學者Rast用亞硝酸誘變TMV番茄株系獲得MⅡ-16弱毒株;日本學者後藤中則ら采用熱處理TMV辣椒株系,獲得弱毒株Pa18;張秀華等用亞硝酸誘變獲得2株TMV弱毒株(N11和N14);鄭貴彬等采用亞硝酸誘變,獲得TMV弱毒株(DN60-3).結果表明,采用熱空氣和亞硝酸的復合處理可顯著提高有效突變頻率,且優(yōu)于單種誘變處理,因而可增加獲得弱毒株的機率.要確定一個合適的誘變劑量,常常要經過多次試驗.單獨使用的適宜劑量對復合處理來說不一定是最適宜的劑量.如對提高突變頻率來說,亞硝酸處理最適劑量的時間為40min或更長,但是復合處理最適劑量的時間為10min或更短.3.2tmv突變株的篩選及鑒定雖然使用誘變劑可提高突變頻率,但是有效的突變頻率還是相對較低的,因而通過誘變處理接種心葉煙后要盡可能多地進行單斑分離.采用一種靈敏度高、檢測量大、快速、簡便的檢測方法即間接ELISA法,就能滿足這些要求,但其出現假陽性的機率較高.出現陽性反應的應再用生物學方法(如接種單斑寄主)進行復檢,出現陰性反應的也可用生物學方法確證.在本實驗中,用間接ELISA法檢測,TMV-152株為陰性,但2次接種強毒株后都不表現癥狀,最后用心葉煙檢測,發(fā)現有枯斑產生,可能是剛開始檢測時TMV-152株的濃度較低的原因.弱毒株的弱毒性能否穩(wěn)定以及對其它植物是否產生危害是在應用弱毒株防治病毒病之前需要考察的內容.我們篩選到的弱毒株經4次毒力鑒定發(fā)現,有2株弱毒性穩(wěn)定,且在可以系統(tǒng)侵染的植物上無癥狀,這為使用弱毒株提供了安全保障.但是弱毒株應用到田間后,弱毒性能否穩(wěn)定,還有待于進一步觀察.一般地,弱毒株的增殖速率比強毒株慢,濃度也較低,我們得到的弱毒株也是如此,這與發(fā)生突變的位點有關,可通過對TMV突變株的核苷酸序列測定,得到確認.而弱毒株的交互保護作用與弱毒株的增殖速率成正相關,因而在篩選弱毒株時也要把增殖速率作為一個指標.同時在接種弱毒株時,要采取相應的接種方法,必要時還可采用血清學方法檢測,以確保接種成功.3.3接種間隔時間及苗期Mckinney發(fā)現植物病毒株系間存在著干擾現象,Kunkel提出利用弱毒株預防強毒株侵染的設想,Holmes通過熱處理獲得TMV弱毒株,并首次報道了利用弱毒株防治番茄花葉病的效果,之后,許多國家都進行了利用弱病毒防治植物病毒病害的研究.到目前為止,已有多種植物病毒的弱毒疫苗研制成功,并已開始小面積推廣試驗工作.關于弱毒株的交互保護作用機理在50年代就有過種種推測,也出現了一些假說,但直到目前還無定論.本實驗考察的4個因素中,弱、強毒株接種間隔時間是影響弱毒株保護作用的重要因素之一.在接種間隔時間為1d(弱毒株增殖還處于潛伏期)、6d(弱毒株已增殖到一定程度,且已運輸到系統(tǒng)葉)、17d(弱毒株在植株體內較充分擴展)時,不管煙苗處于哪個生長階段以及強毒株的接種部位如何,以17d的保護作用為最好,其它組合效果不佳.這說明弱毒株在增殖到一定程度并在植株體內充分擴展后,保護作用才能達到較高水平,這與其他人的結論相符.苗期也是一個重要的因素,在旺長期,弱毒株的交互保護作用最好,這為弱毒株在田間的應用提供了理論依據,也為探討弱毒株的保護作用機理提供了素材.弱毒株在植株體內能否保持穩(wěn)定的濃度以及接種間隔時間如何影響保護作用,還有待于進一步研究.有多種因素影響弱毒株的保護作用,如作物品種,溫度,強、弱毒株接種間隔時間及苗期等.本文嘗試采用正交設計方法來考察這4個因素對弱毒株保護作用的影響,得出的結果與其他方法相似,說明這