中藥指紋圖譜操作指南

中藥指紋圖譜操作指南闡明：本實(shí)驗(yàn)研究規(guī)程指南為在原技術(shù)規(guī)定的基礎(chǔ)上規(guī)中藥注射劑色譜指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究而制訂。本指南未能概括的容，通過實(shí)踐可自行補(bǔ)充調(diào)節(jié)，但申報(bào)資料或復(fù)核資料中須有對(duì)應(yīng)的闡明和申述。指南中的"色譜指紋圖譜"指采用柱色譜及薄層色譜等多個(gè)色譜技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究的指紋圖譜。光譜指紋圖譜將另行規(guī)定。一、供試品收集供試品收集是研究指紋圖譜最初也是最核心的環(huán)節(jié)，由于不可能對(duì)一種藥材的全部樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且生長(zhǎng)環(huán)境條件對(duì)藥材代產(chǎn)物有影響，因此要收集有代表性的供試品。收集不少于10批供試品的含義是指樣本的數(shù)和量要有足夠的代表性。(一)原料藥材：在藥材的化學(xué)成分與中醫(yī)臨床療效的之間的關(guān)聯(lián)尚未能闡明的現(xiàn)階段，基本上是在承認(rèn)其傳統(tǒng)的功效主治及臨床驗(yàn)證的基礎(chǔ)上進(jìn)行指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)研究。原料藥材的指紋圖譜重要是反映其自然狀態(tài)的在質(zhì)量狀況，研究其指紋圖譜是以此作為選擇原藥材投料或混批提取的根據(jù)，同時(shí)作為研究注射劑成品指紋圖譜有關(guān)性的基礎(chǔ)。由于自然條件的變化，藥材個(gè)體之間指紋圖譜的差別是正常的，在品種鑒定無(wú)誤的基礎(chǔ)上，力求藥材有較為固定和穩(wěn)定的來源，個(gè)體之間的指紋圖譜重要特性大致相似即可，使成品指紋圖譜特性的穩(wěn)定有起碼的確保。藥材的"批"不是工業(yè)生產(chǎn)的"批"，是指互相獨(dú)立的供試品，即不能將同一地點(diǎn)或同一渠道同一時(shí)間獲得的供試品分成若干份供試品，以確保明驗(yàn)成果的代表性。由于收集藥材供試品受主觀和客觀的條件限制，供實(shí)驗(yàn)的供試品嚴(yán)格講均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，因此供試品數(shù)越多越好，10批是最低的規(guī)定。供試品應(yīng)確保其真實(shí)性，應(yīng)有完整采樣原始統(tǒng)計(jì)，容涉及：藥材名稱供試品來源（真實(shí)統(tǒng)計(jì)供試品來自何處：傳統(tǒng)產(chǎn)地收集或是資源豐富的產(chǎn)地收集，或者來自GAP基地供應(yīng)；還是產(chǎn)地購(gòu)置、市場(chǎng)購(gòu)置或委托購(gòu)置，等，方便于生產(chǎn)原料的采購(gòu)選擇和測(cè)試數(shù)據(jù)的可追溯）。收集時(shí)間（購(gòu)置時(shí)間）及收集人貨源狀況調(diào)查（貨源與否充足和穩(wěn)定）基原鑒定及鑒定人：產(chǎn)地或GAP基地收集的藥材結(jié)合植物形態(tài)鑒定品種。如缺原植物，由純熟的專業(yè)人員憑性狀或顯微特性鑒別。如近緣品種、難以分辨的野生品種（如白花蛇舌草、蒲公英），應(yīng)在指紋圖譜研究中認(rèn)真比較，如獲得的指紋圖譜相似度很高，也可應(yīng)用，但須明確統(tǒng)計(jì)。并在此后實(shí)施GAP時(shí)擬定一種品種，如指紋圖譜相似度很低，則須擬定品種，改為栽培品使用。商品混亂的品種（如皮）產(chǎn)區(qū)的選擇應(yīng)縮小圍，并結(jié)合資源選用藥典收載品種中的一種。復(fù)方制劑中的君藥及處方量大的藥材必需重點(diǎn)注意品種的鑒定，以避免此后執(zhí)行指紋圖譜過程中出現(xiàn)難以預(yù)料的困難。質(zhì)量評(píng)定：為了便于對(duì)色譜的對(duì)的分析，減少實(shí)驗(yàn)成果的判斷誤差，首先藥材需符合藥典或部頒原則規(guī)定，并具體統(tǒng)計(jì)。全部藥材均須編號(hào)，必要時(shí)附藥材外形照片。供試品的留樣、貯藏和標(biāo)簽：由于指紋圖譜研究周期較長(zhǎng)，供試品必須在干燥、低溫、避光處貯藏，標(biāo)簽必須有編號(hào)，收集供試品的編號(hào)應(yīng)與貯藏樣品、實(shí)驗(yàn)樣品的編號(hào)一致。留樣數(shù)量應(yīng)不少于實(shí)驗(yàn)實(shí)際用量的3倍。以確保明驗(yàn)成果有異議時(shí)的可追溯。如以中藥飲片或炮制品為起始原料，應(yīng)采用符合中國(guó)藥典或飲片炮制規(guī)的供試品。申報(bào)資料可將核心容扼要填寫于表一中：表一（推薦）藥材名稱供試品編號(hào)供試品來源收集時(shí)間（購(gòu)置時(shí)間）及收集人貨源狀況調(diào)查基原鑒定及鑒定人學(xué)名：鑒定人：質(zhì)量評(píng)定供試品留樣數(shù)量：容器：貯藏地點(diǎn)及條件：標(biāo)簽原始統(tǒng)計(jì)保存處附一：藥材外形照片。附二：藥材的色譜圖（實(shí)驗(yàn)完畢后）。(二)半成品(提取物)：藥材所含成分的個(gè)體差別是難以避免的，指紋圖譜研究用的半成品應(yīng)來自生產(chǎn)車間通過藥材混批調(diào)節(jié)及規(guī)的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的實(shí)際樣品。核心技術(shù)及對(duì)應(yīng)參數(shù)填寫于表二，并附實(shí)驗(yàn)完畢后指紋圖譜。表二（推薦）半成品（提取物）名稱混批前批號(hào)日期提取辦法（核心技術(shù)）混批后批號(hào)混批比例原始統(tǒng)計(jì)保存處供試品留樣數(shù)量：??容器：??貯藏地點(diǎn)及條件：??附：混批前后的指紋圖譜。(三)成品(注射劑)：產(chǎn)品批號(hào)、生產(chǎn)單位、成品批號(hào)與半成品（提取物）批號(hào)的有關(guān)性均須有明確的統(tǒng)計(jì)，以確保明驗(yàn)數(shù)據(jù)的可追溯。成品的“對(duì)照用指紋圖譜”是建立在原則化提取物或10批以上產(chǎn)品指紋圖譜的基礎(chǔ)上。各批供試樣品須有留樣。重要容填寫于表三，并附實(shí)驗(yàn)完畢后的指紋圖譜。表三（推薦）供試品批號(hào)生產(chǎn)單位供試品數(shù)量供試品留樣數(shù)量：??容器：??貯藏地點(diǎn)及條件：??指紋圖譜研究用的原藥材、半成品及注射劑成品均應(yīng)有10批以上的樣品供實(shí)驗(yàn)，以確保指紋圖譜的可重復(fù)性。二、供試品溶液的制備(一)藥材供試品溶液的制備取樣：供試品取樣應(yīng)注意代表性，以保持實(shí)驗(yàn)室取樣與實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用藥材一致，例如地上部分的藥材，取樣約0.5～1Kg，分別稱量莖、葉、花、果的大致比例并做統(tǒng)計(jì)。例如果實(shí)類藥材，生產(chǎn)時(shí)去除種子的，供試品也應(yīng)除去種子，并做統(tǒng)計(jì)。如果藥材表觀質(zhì)量不均勻（如大小不一、肥瘦不等、粗細(xì)不勻等），應(yīng)注意供試品的取樣有代表性，其后的實(shí)驗(yàn)中，必要時(shí)應(yīng)做比較實(shí)驗(yàn)，以考察所含成分有無(wú)明顯差別，供生產(chǎn)參考。稱樣：應(yīng)按照常規(guī)規(guī)定，將選用的供試品適宜粉碎后混合均勻，再?gòu)闹蟹Q取實(shí)驗(yàn)所需的數(shù)量，普通稱取供試品與選用樣品的比例為1：10，即如稱取1g供試品，應(yīng)在混合均勻的10g選用的樣品中稱取。由于指紋圖譜需要提供量化的信息，稱取供試品的精度普通規(guī)定取3位有效數(shù)字。制備：藥材指紋圖譜的重要目的，一是考察藥材本身的質(zhì)量狀況，二是以藥材的指紋圖譜為參比，提取物及制劑的指紋圖譜與之比較，以考察制劑與原藥材的有關(guān)性。藥材供試品溶液的制備，可選用適宜的溶劑和提取辦法，定量操作進(jìn)行，盡量使藥材中的成分較多地在色譜圖中反映出來，并達(dá)成較好的分離。最后制備的供試品溶液還應(yīng)能適應(yīng)色譜實(shí)驗(yàn)的需要，如液相色譜的供試品溶液宜用色譜流動(dòng)相或色譜洗脫強(qiáng)度較弱的溶劑；薄層色譜用的供試品溶液可采用液液萃取或固液萃取，選用適宜的溶劑制備供試品溶液。氣相色譜的供試品可采用水蒸氣蒸餾法、頂空進(jìn)樣法或固相微萃取法，供試品如需使用溶劑，應(yīng)用低極性低沸點(diǎn)的溶劑。定容：供試品溶液最后應(yīng)用適宜的溶劑溶于標(biāo)定容量的容器中，制成標(biāo)示濃度的供試品溶液（g/mL或mg/mL）。放置：普通規(guī)定供試品溶液盡量新鮮配制，如持續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，供試品溶液應(yīng)在避光、低溫、密閉容器條件下短期放置，普通不超出兩周，溶液不穩(wěn)定的，普通不超出48小時(shí)。標(biāo)簽：須注明編號(hào)或批號(hào)，應(yīng)與取樣的藥材編號(hào)一致，或有明確的關(guān)聯(lián)，以確保數(shù)據(jù)的可追溯。重要操作過程及數(shù)據(jù)應(yīng)具體統(tǒng)計(jì)。(二)半成品(提取物)供試品溶液的制備：稱取不同批次的半成品（提取物），參考"供試品溶液"的制備辦法中對(duì)應(yīng)的容制備成一定量的溶液，備用。標(biāo)簽須注明編號(hào)或批號(hào)，應(yīng)與取樣的藥材編號(hào)一致，或有明確的關(guān)聯(lián)，以確保數(shù)據(jù)的可追溯。重要操作過程及數(shù)據(jù)應(yīng)具體統(tǒng)計(jì)。(三)成品(注射劑)供試品溶液制備：液體注射劑普通可直接或稀釋后作為供試品溶液，必要時(shí)也可用適宜的溶劑提取并制備成一定量的溶液。固體形式的注射劑（凍干粉針）須注意注射劑成品的附加劑有無(wú)對(duì)色譜實(shí)驗(yàn)干擾。如有干擾，須研究采用適宜的樣品預(yù)解決辦法以排除干擾（如含有氯化鈉則液相色譜不可使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；如糖分太多，可能影響薄層色譜的清晰度和分離度；凍干粉針的骨架劑用量較大時(shí)也可能影響色譜的質(zhì)量等）。另外，單方注射劑藥材或復(fù)方注射劑中不同藥材成分類別如果相差較大，色譜條件規(guī)定不同，需要進(jìn)行樣品的預(yù)解決時(shí)，應(yīng)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，便于制備2以上的指紋圖譜。重要環(huán)節(jié)及數(shù)據(jù)應(yīng)具體統(tǒng)計(jì)。三、參考物(一)參考物的選擇：指紋圖譜的參考物質(zhì)普通選用容易獲取的一種以上注射劑中的重要活性成分或指標(biāo)成分，重要用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性，并有助于色譜的識(shí)別。在與臨床藥效未能獲得確切關(guān)聯(lián)的情形下，參考物（復(fù)方注射劑應(yīng)首選君藥的活性成分或指標(biāo)成分）起著識(shí)別和評(píng)價(jià)色譜指紋圖譜特性的指導(dǎo)作用，它并不等同于含量測(cè)定的對(duì)照品。指紋圖譜普通色譜比較復(fù)雜，標(biāo)物不易選擇，也不易插入，指紋圖譜不是含量測(cè)定，故標(biāo)物的作用也不等同于含量測(cè)定的標(biāo)物，因此應(yīng)謹(jǐn)慎考慮選用標(biāo)物質(zhì)的必要性和可能性。參考物應(yīng)闡明名稱、來源和純度。如無(wú)參考物也可選指紋圖譜中的穩(wěn)定的色譜峰做為參考峰，闡明其色譜行為和有關(guān)數(shù)據(jù)，并應(yīng)盡量闡明其化學(xué)構(gòu)造及化學(xué)名稱。如狀況需要，又有可能也可考慮選擇適宜的標(biāo)物插入色譜中。(二)參考物溶液的制備：精密稱取，用適宜的溶劑制成標(biāo)示濃度的溶液，備用。四、實(shí)驗(yàn)慣用的色譜技術(shù)有薄層色譜、液相色譜、氣相色譜及其它色譜技術(shù)。須注意多個(gè)色譜技術(shù)的特點(diǎn)和局限性，結(jié)合實(shí)際選用。不管何種色譜技術(shù)，選用的原則是必需含有良好的專屬性、重現(xiàn)性和可行性。專屬性：建立的指紋圖譜必須能夠體現(xiàn)該品種的特性，即唯一性。重現(xiàn)性：同一品種同同樣品指紋圖譜中構(gòu)成指紋的各特性峰（斑點(diǎn)）作為整體（峰位、峰數(shù)、峰的豐度、各峰的大致比例）在不同實(shí)驗(yàn)室和不同操作者之間得到的色譜整體特性應(yīng)有較高的相似度，以表明辦法的可行性。同一品種不同樣品之間的相似度不屬于此圍?？尚行裕荷V辦法和實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)易于推廣和便于執(zhí)行，即一旦由藥品監(jiān)督管理部門同意成為質(zhì)量原則的容后，生產(chǎn)公司、中檔水平的分析實(shí)驗(yàn)室和省級(jí)以上的法定檢查機(jī)構(gòu)均可執(zhí)行該原則。(一)實(shí)驗(yàn)室：承當(dāng)色譜指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合下列6個(gè)條件：1、實(shí)驗(yàn)室含有承當(dāng)指紋圖譜的總體能力；2、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備通過檢查證明符合指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究的需要；3、技術(shù)人員含有從事指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究的能力；4、對(duì)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力評(píng)價(jià)應(yīng)有定時(shí)的部的獨(dú)立檢查；5、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有可追溯，與其它實(shí)驗(yàn)室有可比性；6、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有質(zhì)量確保體系，以確保多個(gè)方法實(shí)施的透明和一致。(二)儀器：所用的儀器性能應(yīng)能滿足指紋圖譜實(shí)驗(yàn)的需要，并須經(jīng)校驗(yàn)；如果同一臺(tái)儀器有兩個(gè)以上的項(xiàng)目共用，須有特別方法確保儀器的清洗和維護(hù)，儀器使用要有明確統(tǒng)計(jì)。液相色譜柱統(tǒng)計(jì)商品名稱、生產(chǎn)廠家及有關(guān)參數(shù)（固定相、柱長(zhǎng)度、徑、填料粒度等）；普通需用三根以上不同生產(chǎn)廠家的柱子進(jìn)行比較，經(jīng)比較實(shí)驗(yàn)后應(yīng)固定色譜柱來源與規(guī)格。色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)可用該品種指紋圖譜所用的參考物，參考常法進(jìn)行，如柱效明顯減少，在排除其它因素后，闡明該色譜柱不能繼續(xù)使用。另一辦法是用制作"對(duì)照用指紋圖譜"的提取物留樣樣品定時(shí)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將前后得到的指紋圖譜垂直疊加，直觀比較，各指紋特性峰與否能重疊及整個(gè)色譜的形狀與否有變異，如有變異致使指紋特性已難以識(shí)別，或選擇難分離的一對(duì)或一組峰，其分離度如明顯減少，在排除其它可能的影響因素后，可認(rèn)作該色譜柱不能使用。儀器使用人、使用時(shí)間及周期應(yīng)有統(tǒng)計(jì)。薄層色譜系離線操作，薄層板為一次性器材，不存在重復(fù)使用問題，但不同廠家的商品預(yù)制薄層板質(zhì)量可能不一致，手工自制的薄層板只能供篩選實(shí)驗(yàn)條件使用，用擬定的條件制作指紋圖譜（圖像）時(shí)必須用有質(zhì)量確保的商品預(yù)制薄層板（如Silicagel60，Merck等）。圖譜攝像時(shí)如用數(shù)碼攝像機(jī)，解像度應(yīng)在20,00,000象素以上，熒光色譜須在薄層色譜專用的紫外光燈箱下加濾光片拍攝。如有對(duì)應(yīng)的積分軟件，可立刻生成輪廓掃描圖以及積分?jǐn)?shù)據(jù)；也可用常規(guī)的薄層色譜掃描儀進(jìn)行積分和繪制輪廓圖譜。薄層掃描儀的機(jī)械部分、電子部分及光源需定時(shí)校驗(yàn)。氣相色譜如色譜柱類型、長(zhǎng)度、徑、老化條件、載氣、流速、柱溫、柱頭壓力、進(jìn)樣方式、進(jìn)樣口溫度、檢測(cè)器等均需考察；儀器除定時(shí)檢查校驗(yàn)外，填充柱或毛細(xì)管柱的柱效也應(yīng)參考液相色譜柱定時(shí)校驗(yàn)柱效。其它種類的色譜儀參考上述原則校驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)。多個(gè)儀器均須按照儀器操作手冊(cè)以及SOP進(jìn)行。(三)實(shí)驗(yàn)辦法和實(shí)驗(yàn)條件：色譜指紋圖譜實(shí)驗(yàn)辦法和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)選：實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)能滿足指紋圖譜的需要，不適宜簡(jiǎn)樸套用含量測(cè)定用的實(shí)驗(yàn)條件，并需根據(jù)指紋圖譜的特點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)選。實(shí)驗(yàn)辦法和實(shí)驗(yàn)條件選擇的目的是通過比較實(shí)驗(yàn)，從中選用相對(duì)簡(jiǎn)樸易行的辦法和條件，獲取足以代表品種特性的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現(xiàn)性和普遍合用性的規(guī)定。辦法和條件須通過嚴(yán)格的辦法學(xué)驗(yàn)證。由于色譜指紋圖譜含有量化的概念，因此從樣品的稱取、供試液的制備和進(jìn)行色譜分析時(shí)均須定量操作。在指紋圖譜研究中，"量化"的含義是指在定量操作的條件下所得到的指紋圖譜在整體特性上能夠作半定量的比較，以體現(xiàn)供試品個(gè)體之間指紋圖譜在"量"方面的總體差別程度，以及半成品（提取物）和成品之間及成品批間指紋圖譜在"量"方面的相似程度。選擇實(shí)驗(yàn)辦法及實(shí)驗(yàn)條件須根據(jù)供試品的特點(diǎn)和需要設(shè)計(jì)適宜的實(shí)驗(yàn)方案，在確保專屬性、重現(xiàn)性的前提下，宜選擇簡(jiǎn)樸、實(shí)用、便于實(shí)施的辦法和實(shí)驗(yàn)條件，并需要進(jìn)行辦法學(xué)驗(yàn)證。(四)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的事項(xiàng)：(1)液相色譜的色譜柱需做比較實(shí)驗(yàn)加以選擇，流動(dòng)相最少用三種不同構(gòu)成進(jìn)行比較，并從中選用最適宜的色譜條件?，F(xiàn)在，高效液相色譜普通為反相色譜，采用十八烷基硅烷鍵合相柱，特殊狀況下可選擇其它類型的化學(xué)鍵合相柱。不同生產(chǎn)廠家不同牌號(hào)的色譜柱因選用的硅膠原料、鍵合條件、封尾狀況等的差別，致使在性能上互有差別，故通過實(shí)驗(yàn)比較，選擇適宜的色譜柱很重要，選用的色譜柱最佳是多數(shù)實(shí)驗(yàn)室慣用的。如需梯度洗脫時(shí)，應(yīng)盡量采用線性梯度。并應(yīng)報(bào)告儀器梯度滯后時(shí)間。測(cè)定梯度滯后時(shí)間，可用一零死體積連接器替代色譜柱，以甲醇為溶劑A，含0.1%丙酮的甲醇為溶劑B，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，運(yùn)行0－100%B的線性梯度，梯度時(shí)間20分鐘，流速1.0ml/min，統(tǒng)計(jì)梯度圖形，測(cè)定梯度曲線中間點(diǎn)的時(shí)間，減去10分鐘，即得。不同的儀器，由于梯度滯后時(shí)間的不同，可能影響辦法的重現(xiàn)性，普通可通過調(diào)節(jié)進(jìn)樣和梯度起始時(shí)間減少這種影響。檢測(cè)器最常見的是紫外-可見光檢測(cè)器，文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)波長(zhǎng)經(jīng)常是為含量測(cè)定某一特定成分，不一定完全適合指紋圖譜的需要，為了獲取多層次的信息，經(jīng)常需要選擇數(shù)個(gè)不同的檢測(cè)波長(zhǎng)，條件許可的可使用二極管陣列檢測(cè)器，獲取不同波長(zhǎng)得到的色譜圖，從中汲取更多的信息。對(duì)在紫外區(qū)無(wú)吸取的化合物，也可選擇其它類型的檢測(cè)器，如差示折光檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。(2)薄層色譜普通采用常規(guī)硅膠預(yù)制板或高效硅膠預(yù)制板，必要時(shí)也可選用聚酰胺薄膜板或纖維素薄層板等，選用時(shí)重要是確保色譜圖像的質(zhì)量，劣質(zhì)的預(yù)制板不能使用。展開用溶劑系統(tǒng)的選擇最少需做三種不同展開系統(tǒng)的比較，另外，需注意觀察溫度和相對(duì)濕度對(duì)色譜行為的影響。雜質(zhì)的干擾對(duì)柱色譜，經(jīng)常是"隱性"的；薄層色譜則由于樣品供試液中全部成分均可在薄層板上觀察，因此雜質(zhì)成分對(duì)色譜的干擾是"顯性"的，可直觀地反映在薄層色譜上，甚至直接影響指紋圖譜的觀察，因此樣品供試液的預(yù)解決經(jīng)常是需要考慮的環(huán)節(jié)之一。薄層色譜指紋圖譜宜在同板將"對(duì)照用提取物"與供試品平行比較，即每一薄層板必須有"隨行對(duì)照用提取物"或?qū)?yīng)的參考物。顯色劑分通用顯色劑和專屬顯色劑，結(jié)合使用可在一種色譜條件下得到的指紋圖譜獲取成分類別或化學(xué)成分功效團(tuán)的信息，如生物堿、黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類等，專用的顯色劑能夠直觀地顯示各自的特性。(3)氣相色譜普通使用毛細(xì)管柱，如填充柱得到的色譜即使簡(jiǎn)樸，但如確能體現(xiàn)該品種的指紋特性，也可采用。普通極性與非極性固定相均須比較，以擬定選用適宜的固定相。色譜運(yùn)行時(shí)間能確保供試品中的成分均能流杰出譜柱。如需要將相對(duì)保存時(shí)間作為固定的常數(shù)（"保存指數(shù)"），也可根據(jù)實(shí)際需要和可能選用1,2個(gè)標(biāo)物質(zhì)計(jì)算。如需程序升溫宜采用線性升溫，盡量避免復(fù)雜的多階程序。其它色譜技術(shù)可參考上述基本規(guī)定設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。色譜中的參考峰由于作用不同于含量測(cè)定，提高其分離度應(yīng)以不犧牲色譜的整體特性為前提，因此不應(yīng)孤立地苛求其分離度必需達(dá)成含量測(cè)定的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)研究中普通需要實(shí)驗(yàn)室模擬生產(chǎn)工藝制備供試品溶液，作為實(shí)驗(yàn)室模擬樣品，以考察實(shí)驗(yàn)條件，并與實(shí)際生產(chǎn)的供試品的指紋圖譜作參考比較。由于實(shí)驗(yàn)室制備條件不可能與大生產(chǎn)工藝制備的產(chǎn)品完全一致，在其后的有關(guān)性比較時(shí)，有關(guān)數(shù)據(jù)僅供參考用，如大生產(chǎn)樣品與實(shí)驗(yàn)室模擬樣品指紋圖譜相差十分明顯，則提示有必要從生產(chǎn)工藝和實(shí)驗(yàn)室模擬樣品兩方面檢查因素。五、色譜指紋圖譜的建立和識(shí)別實(shí)驗(yàn)條件確立后，將獲得的全部樣品的指紋圖譜逐個(gè)研究比較，首先實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)將原藥材、半成品（提取物）、成品的指紋圖譜分別直觀比較。一指紋圖譜，特別是分辨率較高的圖譜，必須制備有足夠代表性的樣品的圖譜，認(rèn)真觀察，首先找出藥材色譜含有指紋意義的各個(gè)峰，給以編號(hào)，藥材、半成品和成品之間的圖譜比較，如有缺峰，則缺號(hào)，以保持峰的編號(hào)不變，便于清晰地考察互相之間的有關(guān)性。半成品（提取物）的指紋圖譜與原藥材的指紋圖譜應(yīng)有一定的有關(guān)性，即半成品（提取物）指紋圖譜的特性應(yīng)在原藥材的指紋圖譜中能夠追溯，而原藥材中的某些特性在提取物指紋圖譜中允許因生產(chǎn)工藝關(guān)系而有規(guī)律的丟失。半成品（提取物）指紋圖譜與成品（注射劑）的指紋圖譜應(yīng)有較高的有關(guān)性。中藥復(fù)方注射劑如處方藥味較多，藥量各異，成分復(fù)雜，難以規(guī)定在指紋圖譜中全部體現(xiàn)，但作為原料的各味藥材，必須研究各自的指紋圖譜。有的品種某一種成分含量很高（如黃芩中的黃芩苷），在色譜圖中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其它特性很弱，即使這本身就是特性，但有時(shí)為了區(qū)別用藥材作起始原料和單一成分直接投料（如用黃芩苷替代黃芩藥材），可試用不同的檢測(cè)波長(zhǎng)或不同色譜辦法，突出其它特性，互相參考識(shí)別。有的復(fù)方注射劑數(shù)種藥材均含同一類別的成分，并且成分又較多時(shí)（如人參、三七、黃芪并存），建立指紋圖譜的難度很大，除盡量改善實(shí)驗(yàn)條件，提高色譜的分辨率外，可用陰性對(duì)照，考察有關(guān)峰的疊加關(guān)系，此時(shí)，各指紋峰之間比例的穩(wěn)定成為重要特性。因此更闡明用藥材的原則提取物投料將是必然的發(fā)展趨勢(shì)。指紋圖譜的識(shí)別應(yīng)注意指紋特性的整體性。一種品種的指紋圖譜是由各個(gè)含有指紋意義的峰構(gòu)成的完整圖譜構(gòu)成，各個(gè)有指紋意義的峰（或薄層色譜的斑點(diǎn)）其位置（保存時(shí)間或比移值）、大小或高低（積分面積或峰高）、各峰之間相對(duì)的比例是指紋圖譜的綜合參數(shù)，識(shí)別和比較時(shí)從整體的角度綜合考慮，注意各有指紋意義的峰互相的依存關(guān)系。液相色譜不同儀器可能因滯留體積不同等因素造成保存時(shí)間的漂移。薄層色譜的比移值不同實(shí)驗(yàn)室漂移現(xiàn)象更較常見，因此比較色譜的整體特性很重要，不適宜糾纏細(xì)枝末節(jié)。指紋圖譜的評(píng)價(jià)指標(biāo)是供試品指紋圖譜與該品種對(duì)照用指紋圖譜（共有模式）及供試品之間指紋圖譜的相似性。指紋圖譜的相似性從兩個(gè)方面考慮，一是色譜的整體"面貌"，即有指紋意義的峰的數(shù)目、峰的位置和次序、各峰之間的大致比例（薄層色譜尚有斑點(diǎn)的顏色）等與否相似，以判斷樣品的真實(shí)性。二是供試品與對(duì)照樣品或"對(duì)照用指紋圖譜"之間及不同批次樣品指紋圖譜之間總積分值作量化比較。如總積分面積相差較大（如±20%），則闡明同樣量的樣品含有的在物質(zhì)有較明顯的"量"的差別，這種差別與否允許，應(yīng)視具體品種，具體工藝的實(shí)際狀況，并結(jié)合含量測(cè)定項(xiàng)目綜合判斷。這種比較應(yīng)在同一臺(tái)儀器平行進(jìn)行測(cè)定。為了減輕日常檢查的煩瑣計(jì)算，積分?jǐn)?shù)據(jù)能夠簡(jiǎn)化為3位有效數(shù)字，或者直接讀取圖譜縱坐標(biāo)的刻度值。由于積分值本身由于不同成分響應(yīng)不同，并且量的多少與真值不一定呈線性關(guān)系；指紋圖譜的功效不同于含量測(cè)定，它只需要數(shù)量的大概信息。相似性比較能夠用"相似度"體現(xiàn)，相似度能夠借助藥典會(huì)推薦的"中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件"計(jì)算，除個(gè)別品種視具體狀況而定外，普通成品指紋圖譜相似度計(jì)算成果在0.9～1.0（或以90～100表達(dá)）之間作為符合規(guī)定。自行開發(fā)的軟件必需公開算法。申報(bào)資料中除相似度計(jì)算成果外，需附指紋圖譜。相似度不大于0.9，但直觀比較難以否認(rèn)的供試品，可進(jìn)一步采用模式識(shí)別辦法（如主成分分析）檢查因素。六、色譜指紋圖譜的校驗(yàn)和復(fù)核生產(chǎn)公司申報(bào)的色譜指紋圖譜須經(jīng)獨(dú)立于生產(chǎn)公司以外的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行校驗(yàn)，以確認(rèn)其專屬性和重現(xiàn)性。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局指定的省級(jí)藥品檢查所負(fù)責(zé)研制單位申報(bào)資料的技術(shù)審核與實(shí)驗(yàn)復(fù)核，除另有規(guī)定外，已上市品種的指紋圖譜復(fù)核，猶如品種經(jīng)統(tǒng)一研究擬定辦法的指紋圖譜原則復(fù)核由省級(jí)藥品檢查所進(jìn)行；廠家自己研制的指紋圖譜原則復(fù)核由省級(jí)藥品檢查所進(jìn)行，并由國(guó)家藥典會(huì)組織另一藥品檢查所對(duì)其進(jìn)行二次復(fù)核。半成品（提取物）不做復(fù)核實(shí)驗(yàn)，只做文字資料的技術(shù)審核，以判斷成品與原料及半成品（提取物）的有關(guān)性以及申報(bào)資料容與否合理。進(jìn)行資料審核時(shí)注意申報(bào)的資料與否進(jìn)行系統(tǒng)的辦法學(xué)考察和驗(yàn)證，書面審核容涉及提取辦法、提取溶劑、色譜柱或薄層板、色譜系統(tǒng)、檢測(cè)波長(zhǎng)等的選擇；精密度、辦法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及成品儲(chǔ)放后指紋圖譜的穩(wěn)定性等考察，成果可通過相似度軟件檢查，成果相似度均應(yīng)在0.9以上。所申報(bào)的上述資料應(yīng)書寫規(guī)，數(shù)據(jù)齊全。除狀況確實(shí)需要外，普通復(fù)核單位不再進(jìn)行辦法學(xué)復(fù)核實(shí)驗(yàn)，但復(fù)核單位本身對(duì)注射劑成品的復(fù)核實(shí)驗(yàn)仍須進(jìn)行本身的辦法學(xué)驗(yàn)證。復(fù)核申報(bào)的指紋圖譜實(shí)驗(yàn)，應(yīng)與原申報(bào)資料提供的實(shí)驗(yàn)條件相似。如復(fù)核成果難以與申報(bào)資料的指紋圖譜吻合，應(yīng)結(jié)合申報(bào)資料的有關(guān)容和數(shù)據(jù)以及復(fù)核單位的全部圖譜及數(shù)據(jù)，客觀地公正地分析因素。必要時(shí)，由第三方再?gòu)?fù)核。也能夠隨行對(duì)照用提取物為參考，與供試品由申報(bào)單位和復(fù)核單位分別在各自實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核對(duì)實(shí)驗(yàn)，雙方供試品與對(duì)照用提取物的指紋圖譜平行比較。如各自均能重復(fù)本身的成果，而色譜的指紋特性又能夠互相印證，雖與原則所附對(duì)照用指紋圖譜有所差別，但相似度檢查均能通過，也可考慮予以承認(rèn)。但同一實(shí)驗(yàn)室在完全相似的條件下獲得的指紋圖譜不應(yīng)發(fā)生上述狀況。故每次檢查時(shí)均應(yīng)用隨行對(duì)照提取物同時(shí)實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行相似度檢查。(一)送樣程序已上市品種的指紋圖譜，猶如品種經(jīng)統(tǒng)一研究擬定辦法的指紋圖譜，其研究資料與制劑由生產(chǎn)廠家送所在地的省級(jí)藥品檢查所復(fù)核，再轉(zhuǎn)報(bào)國(guó)家藥典會(huì)。如生產(chǎn)廠家自己研究的指紋圖譜，其研究資料及藥材與制劑送所在地省級(jí)藥品檢查所復(fù)核，再由國(guó)家藥典會(huì)委托另一藥品檢查所對(duì)其制劑進(jìn)行二次復(fù)核。(二)實(shí)驗(yàn)復(fù)核1.按研制單