白花丹參總丹參酮對血栓閉塞性脈管炎大鼠模型的治療作用

白花丹參總丹參酮對血栓閉塞性脈管炎大鼠模型的治療作用

動(dòng)脈硬化性血栓形成（tho）是一種特定的非動(dòng)脈硬化性疾病，主要影響小腿骨和周圍血管，主要影響下肢中的小動(dòng)脈和靜脈。其臨床特點(diǎn)為患肢皮膚發(fā)涼、間歇性跛行,嚴(yán)重者有肢端潰瘍或壞死,是我國慢性周圍血管病中較常見的病種。白花丹參(SalviamiltiorrhizaBungef.alba)是唇形科植物丹參的變型,主產(chǎn)于山東,根入藥。除具有丹參的作用和用途外,臨床發(fā)現(xiàn)白花丹參對治療TAO具有獨(dú)特療效,為了探討白花丹參治療TAO的有效物質(zhì)及其機(jī)理,本文從體征、病理變化及血清中TXB2、6-K-PGF1α、ET等方面觀察了白花丹參總丹參酮對TAO大鼠模型的影響。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar雄性大白鼠60只,體質(zhì)量280～300g,由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2化學(xué)試劑及試劑白花丹參總丹參酮提取物(由本實(shí)驗(yàn)室制備)、LCMS-2020色譜儀(島津公司)、乙腈(色譜純)、冰乙酸(分析純)、通塞脈片(江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司),批號(hào):Z32020535、月桂酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),批號(hào):F200909284;血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α、ET酶免試劑盒(RD公司),批號(hào):20110501A。1.3高效液相色譜法取白花丹參總丹參酮提取物約5mg,精密稱定,置5mL容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過即得。參照文獻(xiàn)采用AgilentEclipseXDB-C18柱(250mm×4.6mmi.d,5μm)色譜柱;以乙腈為流動(dòng)相A相,以0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相B。線性梯度洗脫時(shí)間程序?yàn)?min,20%A;20min,60%A;50min,80%A;流速0.8mL/min;UV檢測波長270nm;進(jìn)樣量10μL。2方法2.1模型制備和給藥60只大鼠隨機(jī)為假手術(shù)組(6只)、模型組(10只)、通塞脈片陽性對照組(10只)、白花丹參高劑量組(11只)、中劑量組(12只)和低劑量組(11只)。參照文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn),制作TAO模型:將大鼠用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉,右下肢股內(nèi)側(cè)剪毛。酒精皮膚消毒,縱行切開約1.5cm切口,游離股動(dòng)脈,用動(dòng)脈夾阻斷血流,假手術(shù)組于動(dòng)脈夾下方遠(yuǎn)心端注入0.2mL生理鹽水,其余大鼠注入0.2mL月桂酸。各組均于注射月桂酸后15min去掉動(dòng)脈夾,縫合皮膚,觀察結(jié)果。各組均于手術(shù)前灌胃給藥,通塞脈片對照組給通塞脈片0.66g/kg,高劑量組給白花丹參總丹參酮提取物40g/kg(相當(dāng)于生藥濃度),中劑量組給白花丹參總丹參酮提取物20g/kg,低劑量組給白花丹參總丹參酮提取物10g/kg。假手術(shù)組和模型組均給予等容量羧甲基纖維素鈉溶液,1次/d,連續(xù)1w。2.2疾行狀況分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)大體觀察大鼠患肢皮膚顏色、溫度、患肢有無腫脹、有無壞疽及壞疽的程度、跛行狀況。參照王軍等采用的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí),Ⅰ級(jí):病變局限于趾甲部;Ⅱ級(jí):病變局限于趾部;Ⅲ級(jí):病變局限于足爪部;Ⅴ級(jí):病變局限于膝關(guān)節(jié)以下;V級(jí):病變發(fā)展到膝關(guān)節(jié)以上。2.3纖維組織病理學(xué)觀察全部送檢的截肢標(biāo)本解剖出月桂酸注射處以下部位的動(dòng)脈、靜脈主干,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色,觀察血管平滑肌、纖維組織病變情況。同時(shí)分別對動(dòng)脈壁炎性細(xì)胞浸潤、纖維增生等情況進(jìn)行觀察。2.4血漿txb2、6-k-pgf1、et試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫法測定,具體步驟參照說明書。2.5統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,計(jì)數(shù)等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn),計(jì)量資料采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析處理。3結(jié)果3.1紫外吸收色譜圖/UV/MS圖譜獲取按“1.3”項(xiàng)下色譜條件,對白花丹參總丹參酮的主要成分進(jìn)行分析,所得到紫外吸收色譜圖(圖1-A)與總離子流色譜圖(圖1-B)基本吻合。應(yīng)用ESI-MS技術(shù),對總離子流色譜圖中的各色譜峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到一級(jí)質(zhì)譜圖,按各色譜峰的質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)核對,對相應(yīng)的化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推測,結(jié)果見表1。3.2肢體長期造模肢體勞動(dòng)大鼠經(jīng)股動(dòng)脈注入月桂酸造模后,各鼠患肢皮膚溫度降低,約5min后足爪部開始出現(xiàn)不同程度的蒼白,腫脹。次日造模成功的大鼠均出現(xiàn)造模肢體缺血表現(xiàn)、跛行或拖曳現(xiàn)象、肢體青紫顏色加深并逐漸向上發(fā)展。一周內(nèi)有部分大鼠出現(xiàn)肢端糜爛、潰瘍及炎癥反應(yīng),有膿液滲出,惡臭味,少數(shù)大鼠出現(xiàn)患側(cè)壞疽部分脫落,患肢的脛后肌群出現(xiàn)嚴(yán)重壞死。模型組的病變最嚴(yán)重,通塞脈片組與中、高劑量給藥組的病變最輕,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),低劑量組與模型組比較沒有顯著性差異,見表2。3.3血栓形成的組織假手術(shù)組股動(dòng)脈均呈通暢狀態(tài),內(nèi)膜光滑完整,無剝離和脫落現(xiàn)象,血管內(nèi)無血栓形成,無炎性細(xì)胞浸潤;TAO模型大鼠股動(dòng)脈內(nèi)均有不同程度的血栓形成。對于模型組,在低倍鏡下觀察,表現(xiàn)為動(dòng)脈壁增厚,動(dòng)脈管腔內(nèi)發(fā)生血栓性閉塞,未見再通,內(nèi)膜大部分脫落,外膜炎性細(xì)胞浸潤較其他組別明顯,伴行靜脈內(nèi)亦有血栓形成;在高倍鏡下觀察,內(nèi)皮細(xì)胞部分發(fā)生水腫、變性、壞死或脫失。通塞脈片組與中、高劑量給藥組的血栓范圍均減少,管腔較規(guī)則,血管及周圍組織少量炎性細(xì)胞的浸潤,炎癥反應(yīng)減輕。低劑量組動(dòng)脈壁增厚,炎性細(xì)胞浸潤及血栓形成較嚴(yán)重,效果不明顯。見圖2。3.4各組大鼠血清中6-k-pgf1、txb2、et的含量比較與假手術(shù)組比較,模型組血清中6-K-PGF1α含量降低,TXB2、ET顯著升高(P<0.05);與模型組相比,通塞脈片組及白花丹參總丹參酮高、中劑量組6-K-PGF1α含量顯著升高,TXB2、ET含量與模型組降低(P<0.05)。低劑量組TXB2含量顯著降低(P<0.05),但6-K-PGF1α及ET的含量改變不明顯。見表3。4丹參酮a、txb2、et目前,TAO的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,但血管內(nèi)皮細(xì)胞(VascularEndothelialCell,VEC)功能受損是其重要的一個(gè)方面。內(nèi)皮素ET、血栓素TXA2及前列環(huán)素PGI2等是由VEC直接合成分泌或經(jīng)VEC轉(zhuǎn)化的生物活性物質(zhì),這些物質(zhì)與血栓的形成密切相關(guān)。丹參酮對心血管系統(tǒng)具有廣泛的作用,主要表現(xiàn)為對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明,丹參酮具有抑制炎癥的作用,這種作用可能與丹參酮抑制炎癥細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān),同時(shí)與抑制花生四烯酸的代謝也有關(guān)系。丹參酮ⅡA可降低全血血小板粘附分子CD41和CD62P的表達(dá),從而起到抗血栓形成和血小板聚集的作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)造模后均有不同程度的血栓形成,TXB2、ET含量顯著升高,6-K-PGF1α含量降低。TXA2、PGI2系統(tǒng)的失衡及ET含量的升高加重和促進(jìn)了TAO的形成和發(fā)展,這些因子既反應(yīng)血小板的聚集情況,更可反應(yīng)血管內(nèi)皮的抗血栓功能。造模大鼠經(jīng)白花丹參總丹參酮治療后,