遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)十 目的基因的克隆與鑒定

四、實(shí)驗(yàn)步驟1連接：pMD18-T載體（Takara試劑盒）pMD18-T

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1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加樣16℃30min2轉(zhuǎn)化:

全量(10ul)加入50ul感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)60min3培養(yǎng)鑒定:

10000轉(zhuǎn)，離心2min，取200ul上清丟棄，其余混勻。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨芐），37℃10-15小時(shí)觀察，白色菌斑為重組型。實(shí)驗(yàn)十目的基因的克隆與鑒定實(shí)驗(yàn)十、目的基因的克隆與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆漳康幕蚱芜B接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、菌落培養(yǎng)鑒定方法。為基因測序和其它研究和應(yīng)用準(zhǔn)備高質(zhì)量的基因片段。連接:回收目的基因片段同克隆載體連接轉(zhuǎn)化:將重組載體導(dǎo)入細(xì)菌篩選:通過抗性基因和顯色反應(yīng)選擇重組載體回收:在細(xì)菌中大量繁殖重組載體并回收鑒定:菌落和重組載體是否含目的基因片段實(shí)驗(yàn)流程二、實(shí)驗(yàn)原理1、連接Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A；T載體是一種帶有3’T突出端的載體；在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。

高效克隆PCR產(chǎn)物（TACloning）的專用載體2、轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法,化學(xué)試劑法（CaCl2)等的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。3、鑒定--

α-互補(bǔ)質(zhì)粒載體帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。宿主細(xì)胞存在可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它們同時(shí)存在時(shí)，能恢復(fù)lacZ酶的活性，稱為α-互補(bǔ)。在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。三、實(shí)驗(yàn)材料1連接：

基因：菠菜actin基因的部分序列（純化的PCR產(chǎn)物）

載體：pMD18-T載體。（Takara試劑盒）2轉(zhuǎn)化

重組質(zhì)粒（上步結(jié)果）

感受態(tài)細(xì)胞DH5α（天根生物）

液體SOC培養(yǎng)基（或LB培養(yǎng)基）3鑒定LB固體培養(yǎng)基（IPTG,X-Gal,氨芐）

四、實(shí)驗(yàn)步驟1連接：pMD18-T載體（Takara試劑盒）pMD18-T

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1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加樣16℃30min2轉(zhuǎn)化:

全量(10ul)加入50ul感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)60min3培養(yǎng)鑒定:

10000轉(zhuǎn)，離心2min，取200ul上清丟棄，其余混勻。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨芐），37℃