各突變檢測方法比較

1、RNA酶A切割法（RNaseAcleavage）在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，RNaseA在錯配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯配堿基為嘧啶時，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一種條鏈，突變檢出率只有30％，猶如時分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于1-2kb的大片段進(jìn)行檢測，并能擬定突變位點(diǎn)。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種典型辦法用于對未知突變進(jìn)行分析。電泳法（不能擬定突變位點(diǎn)，都要通過測序等解決）2、變性梯度凝膠電泳（DGGE）雙鏈DNA分子在普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被分辨開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為同樣，因此不能被分辨。DGGE/TGGE技術(shù)在普通的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段分辨開來。一種特定的DNA片段有其特有的序列構(gòu)成，其序列構(gòu)成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain,MD)和解鏈行為(meltingbehavior)。一種幾百個堿基對的DNA片段普通有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段持續(xù)的堿基對構(gòu)成。當(dāng)變性劑濃度逐步增加達(dá)成其最低的解鏈區(qū)域濃度時，該區(qū)域這一段持續(xù)的堿基對發(fā)生解鏈。當(dāng)濃度度再升高依次達(dá)成各其它解鏈區(qū)域濃度時，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到變性劑濃度達(dá)成最高的解鏈區(qū)域濃度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈DNA完全解鏈。如果不同DNA片段的序列差別發(fā)生在最高的解鏈區(qū)域時，這些片段就不能被分辨開來。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，普通30-50個堿基對）能夠解決這個問題。含有GC夾子的DNA片段最高的解鏈區(qū)域在GC夾子這一段序列處，它的解鏈濃度很高，能夠避免DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC夾子后，DNA片段中基本上每個堿基處的序列差別都能被分辨開。3、PCR-SSCP法單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)是一種分離核酸的技術(shù)，能夠分離相似長度但序列不同的核酸（性質(zhì)類似于DGGE和TGGE，但辦法不同）。實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)運(yùn)用PCR從提取出的DNA中擴(kuò)增16SrRNA基因。運(yùn)用λ-外切核酸酶消化掉一條鏈（其中一種PCR引物被磷酸化，這條鏈將被去除）。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。應(yīng)用：單鏈構(gòu)象多態(tài)性可用于預(yù)篩選克隆文庫?？蓪ζ渲械哪骋环N條帶進(jìn)行測序，并與數(shù)據(jù)庫中已知序列比對。原理：單鏈DNA在中性條件下會形成二級構(gòu)造，這種二級構(gòu)造依賴于其堿基構(gòu)成，即使是一種堿基的不同，也會形成不同的二級構(gòu)造并引發(fā)在非變性電泳條件不同的電泳遷移率。4、雜合雙鏈分析法(HA)由突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一種凸起,在非變性膠中電泳時,會產(chǎn)生與對應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率,從而使兩者被分離開。該辦法原理與單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)相似,只但是SS-CP分離的是單鏈,而HA法分離的是雙鏈。HA法簡樸快速,但只合用于200～300pb的片段,且不能擬定突變位置,檢出率只有80%左右,有人建議將HA法和SSCP法聯(lián)合使用,可能將檢出率提高到靠近100%,也有科研工作者建議使用缺失的野生型等位基因來提高該辦法的敏捷度。5、化學(xué)切割錯配(CCM)化學(xué)切割錯配是在Maxam-Gilbert測序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)突變檢測技術(shù),在DNA∶DNA或DNA∶RNA異源雜合雙鏈核酸分子中,錯配的C能被羥胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,錯配的T能被四氧化鋨(Osmiumtetroxide)所切割,切割產(chǎn)物跑變性膠電泳即可擬定與否存在突變。只要操作得當(dāng),不會發(fā)生非特異性切割,如果對正義鏈和反義鏈都進(jìn)行分析,可使檢出率達(dá)成100%;使用熒光檢測系統(tǒng)將會大大增強(qiáng)該辦法的敏捷度,從而可檢測出十個細(xì)胞中的一種突變細(xì)胞。該辦法的最大優(yōu)點(diǎn)是能對長至2kb的片段分析,并能擬定突變位置,缺點(diǎn)是環(huán)節(jié)多,費(fèi)時,且需接觸有毒的化學(xué)物質(zhì)。6、碳化二亞胺檢測(Carbodiimide,CDI)與CCM法相似,CDI能夠?qū)﹀e配的G和T進(jìn)行修飾,當(dāng)用標(biāo)記的引物對CDI修飾過的雙鏈DNA進(jìn)行DNA合成時,延伸會在修飾過的堿基處終止下來,合成產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳即可檢測出與否有突變。該辦法的最大優(yōu)點(diǎn)也是能對1～2kb的片段進(jìn)行分析,突變檢出率達(dá)成100%,能擬定突變位置,并且CDI是一種沒有毒性的物質(zhì),有報道曾用該法檢測出了7.2kbDNA片段中的一種點(diǎn)突變,但當(dāng)一種DNA片段中存在多個突變時,該辦法就不合用。7、酶促切割錯配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)EMC是一種與RNaseA切割相類似的辦法。T4核酸內(nèi)切酶是一種分解酶(resolvase),能夠識別12種錯配的堿基并在錯配堿基的附近進(jìn)行切割，酶切產(chǎn)物跑變性膠或中性膠即可檢測出與否有突變，電泳產(chǎn)物的檢測可用放射自顯影，也可用銀染。由于該法能對DNA∶DNA異源雜合分子進(jìn)行分析，因而省去了體外轉(zhuǎn)錄的環(huán)節(jié)，其最長檢測片段可達(dá)成1.5kb，該法的缺點(diǎn)是存在非特異性切割現(xiàn)象，并且對有些錯配堿基的識別不是100%，因此在每次檢測時都必須設(shè)有一種內(nèi)對照。8、限制性片斷長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)連瑣分析技術(shù)RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差別，這種差別是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引發(fā)的。RFLP技術(shù)重要涉及下列基本環(huán)節(jié)：DNA提取→用限制性內(nèi)切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開DNA片段→把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上→運(yùn)用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和成果分析。其檢測特點(diǎn)是：含有較高的特異性，能夠擬定突變的部位及性質(zhì)，重復(fù)性好。但局限性之處是僅適合于多態(tài)性的檢測：即突變頻率不不大于1%才干被檢測到；因此，RFLP分析對于檢測突變的早期，特別是在野生型遠(yuǎn)多于突變型時其敏感性就顯得局限性了。發(fā)展：反向限制性位點(diǎn)突變分析（iRSM），進(jìn)行低突變頻率等位基因的檢測。其辦法重要用于突變早期的檢測，當(dāng)某一野生型序列發(fā)生突變造成原有酶切位點(diǎn)（E1位點(diǎn)）的消失，產(chǎn)生一新的酶切位點(diǎn)（E2位點(diǎn)），稱之為E1→E2突變，但突變頻率較低常規(guī)RFLP無法檢測。此時，用一內(nèi)切酶(E1)對其進(jìn)行酶切，這樣可選擇性地移去大部分的野生型序列（>99%）。無酶切位點(diǎn)的部分通過PCR擴(kuò)增（引物被設(shè)計(jì)在E2位點(diǎn)的一側(cè)），產(chǎn)物用另一內(nèi)切酶（E2）進(jìn)行RFLP分析，根據(jù)產(chǎn)物中與否存在E2位點(diǎn)即可判斷有無突變發(fā)生。由于該辦法在RFLP分析之前用另一種內(nèi)切酶對靶序列進(jìn)行消化，減少了野生型序列的含量（普通消化率>99%），因而大大提高了突變序列的檢出率。值得注意的是：只要選擇適宜的限制性酶切位點(diǎn)，此項(xiàng)技術(shù)適應(yīng)于任何基因、突變或生物體。但是，由于聚合酶的關(guān)系，可能在PCR擴(kuò)增后造成iRSM分析出現(xiàn)假陽性。這能夠通過使用高保真聚合酶進(jìn)行修正；同時為了提高檢出率，iRSM分析可于其它分析技術(shù)聯(lián)合使用或增加目的基因的含量。9、切割片段長度多態(tài)性(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技術(shù)是在限制性酶切片段長度多態(tài)性(RELP)和SSCP基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種基因突變檢測技術(shù)，其原理是:雙鏈DNA變性后形成的單鏈在中性條件下形成二級構(gòu)造(包含多個折疊的發(fā)夾狀構(gòu)造),正如SSCP同樣,這種二級構(gòu)造取決于DNA的核苷酸構(gòu)成和次序,即使有一種堿基的差別,也會形成不同數(shù)目的折疊狀發(fā)夾構(gòu)造,而CleavaseI外切酶能識別這種發(fā)夾構(gòu)造,并在該構(gòu)造的附近進(jìn)行切割,切割產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠檢測,突變的DNA將出現(xiàn)與正常對照不同的酶切圖譜。10、PCR-ELISA結(jié)合微測序檢測點(diǎn)突變（PCR-ELISA&mini-sequencing）新近有報道稱：使用PCR-ELISA結(jié)合微測序檢測到無臨床癥狀且未經(jīng)抗病毒藥品治療的乙肝患者HBV基因的YMDD主題突變區(qū)存在天然Lamivudine耐藥基因。其檢測原理以下：探針結(jié)合區(qū)野生型HBV基因序列：5-…739ATACGG744A…-3′,針對突變區(qū)域設(shè)計(jì)的探針，Wild-Probe:5-…ATACGG-3′；Val-Probe:5-…ATGTIG-（針對741～742位點(diǎn)突變，743位點(diǎn)設(shè)計(jì)擺動配對）；Ile-Probe:5-…ATATAG-3′、5-…ATATCG-3′、5-…ATATCG-3′（針對743位點(diǎn)突變）。變性的擴(kuò)增產(chǎn)物與上述3種類型探針雜交后，再加入含生物素-7-dATP、Taq酶和Mg2+等的微測序緩沖液55℃溫育。如果Val或Ile探針與靶DNA完全匹配，探針3′末端延伸一種帶標(biāo)記的腺嘌呤。反之，不匹配時，探針Tm減少，3′末端游離而不延伸標(biāo)記的腺嘌呤。運(yùn)用鏈酶親和素酶標(biāo)系統(tǒng)檢測探針上標(biāo)記的生物素，可判斷樣品中與否存在點(diǎn)突變。而近期我們所進(jìn)行的點(diǎn)突變檢測是基于PCR-ELISA和雜交鏈穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，重要是運(yùn)用野生型和突變型序列與探針結(jié)合后在Tm值上的差別進(jìn)行檢測。近年來隨著新技術(shù)、新材料的不停涌現(xiàn)，已知基因單位點(diǎn)突變檢測技術(shù)將會得到快速的發(fā)展，從而距離抱負(fù)的突變掃描辦法（即：對大片段DNA進(jìn)行突變掃描，100%的檢出率，無假陽性或假陰性現(xiàn)象，不需復(fù)雜的設(shè)備、耗費(fèi)低、不需使用有害試劑和同位素、高效率、耗時短。）越來越近。11、變性高效液相色譜分析（denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC）優(yōu)點(diǎn)：高通量檢測、自動化程度高、敏捷度和特異性較高、檢測DNA片段和長度變動范疇廣、相對價廉等。在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保存時間的差別，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保存時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中體現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。DHPLC高度自動化，能夠自動取樣，檢測每個樣品只需要8分鐘左右。DHPLC與其它檢測DNA突變辦法的最大不同在于，它能夠純化DNA片斷。固然，只能檢測雜合突變是DHPLC的局限性之處，但是這能夠運(yùn)用混合的辦法（即將純合突變樣品和野生型樣品混合）來解決。在諸多的研究中，DHPLC色譜圖有變化的樣本經(jīng)測序均顯示DNA有變異；在我們的前期工作中曾用該辦法檢測了大量樣本，特異性及敏感性均靠近100%，提示該辦法是一種高效、可靠的突變檢測辦法。該辦法的局限性之處是無法得出具體的突變位點(diǎn)及突變類型，還需DNA測序辦法證明。12、DNA測序(Sequencing)由多個突變檢測技術(shù)檢測到的突變最后都得由測序來擬定突變類型及突變位置,并且測序法檢測突變的效率達(dá)成100%。但缺點(diǎn)是耗費(fèi)昂貴,因此對某些較大的,外顯子較多的基因不適宜用測序法直接檢測突變,同時也不合用于臨床對大量的標(biāo)本進(jìn)行檢測,另外,測序也不能被當(dāng)成是突變檢測的金原則,雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數(shù)據(jù)。Sanger法測序：運(yùn)用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨(dú)的反映構(gòu)成，每個反映含有全部四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺少延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反映中對應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度能夠調(diào)節(jié)，使反映得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們含有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠解決后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。13、雙脫氧指紋圖譜法(DideoxyFinger-printing,ddF)由于SSCP檢測辦法的敏捷度受到電泳溫度、PCR片段大小等因素的影響,而直接DNA測序的辦法又費(fèi)時、費(fèi)錢，因此有研究工作者在實(shí)際應(yīng)用中將SSCP和Sanger雙脫氧測序法結(jié)合起來形成一種新的突變檢測辦法,即ddF。該辦法的基因原理是:將PCR產(chǎn)物回收純化后用兩個引物分別做Sanger雙脫氧測序反映,但不同的是僅加入一種雙脫氧終止劑,反映產(chǎn)物跑中性聚丙烯酰胺凝膠電泳如果確有突變的話,在病人的電泳圖譜上將會丟失或獲得一條帶或者最少有一條帶的遷移率會發(fā)生變化。在ddF辦法中,DNA鏈的遷移率不僅取決于其二級構(gòu)造,并且與其大小有關(guān),因而較SS-CP法更為敏捷。MartincicD等曾經(jīng)將SSCP法和ddF法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)ddF能將10種已知的p53抑瘤基因突變?nèi)繖z測出來,而SSCP法只能檢測到10種突變中的6種。ddF法的敏捷度不受電泳溫度的影響,所能檢測到10種突變中的6種。ddF法的敏捷度不受電泳溫度的影響,所能檢測的PCR產(chǎn)物長度也能達(dá)成近500bp,并且該法還能對突變位置進(jìn)行相對定位。該法的重要缺點(diǎn)是需要使用同位素,同時對回收的PCR產(chǎn)物純度規(guī)定較高,非特異的PCR產(chǎn)物將嚴(yán)重影響到最后成果的分析。14、寡核苷酸連接分析法(oligonucleotideligationassay，OLA)該技術(shù)使用1對標(biāo)記的探針，其中1條探針3'端包含等位基因特異性堿基。先用PCR擴(kuò)增包含HPA基因SNP位點(diǎn)的基因片段，然后探針和擴(kuò)增的等位基因片段互補(bǔ)結(jié)合，在DNA連接酶的作用下，2條探針連接形成一種雙標(biāo)記的產(chǎn)物。這個雙標(biāo)記產(chǎn)物的一端連于固相表面，另一端的標(biāo)記物作為批示物，能夠用ELISA辦法檢測。該法快速、可靠，能夠用于大量樣本的基因分型，但是OLA法也需要某些PCR后的操作，需要序列特異性探針。15、熔解曲線分析法：染料法和FRET法基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理的熔解曲線分析法是羅氏公司的專利技術(shù)。FRET法使用2個探針，一條探針橫跨HPA（血小板特異性抗原）的SNP位點(diǎn)，稱為檢測探針。另一條探針與第一條探針相距1—5個堿基稱為錨定探針。兩條探針互相鄰近的3'端和5'端分別標(biāo)記上熒光物質(zhì)FITC和LightCyclerRed640。在PCR過程中，兩條探針和擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，熒光物質(zhì)FITC和LightCyclerRed640互相靠近。FITC受激發(fā)產(chǎn)生熒光，又激發(fā)Red640，使其發(fā)出波長為640的熒光，通過檢測器檢測熒光信號。在PCR反映后，減少體系溫度到探針退火的溫度下列，然后緩慢提高溫度，檢測探針發(fā)生解鏈從模板脫離，產(chǎn)生1個熔解曲線。如果檢測探針和靶基因完全互補(bǔ)，將會產(chǎn)生一種較高的解鏈溫度（Tm），如果發(fā)生錯配將會產(chǎn)生1個較低的Tm，根據(jù)Tm的不同而將其分離。但該辦法需要特殊的儀器LightCycler熒光定量PCR儀。除了使用FRET技術(shù)之外，還能夠使用DNA熒光染料作為熒光的來源，通過擴(kuò)增子或未標(biāo)記探針的熔解分析法來進(jìn)行基因分型。Liew等使用該法對HPA進(jìn)行了基因分型并和FRET探針法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這2種辦法的一致性達(dá)98.8％。Liew等進(jìn)一步的研究表明，使用擴(kuò)增子的熔解分析法在分析長片段的擴(kuò)增子時，存在一定的錯誤率，而使用未標(biāo)記探針的成果則是完全精確的。這種點(diǎn)突變分析技術(shù)的特點(diǎn)是簡樸、快速、自動化程度較高，易于推廣?；跓晒馊玖系娜劢夥治龇o需價格昂貴的熒光標(biāo)記的雙雜交探針，并且每一種反映體系能夠同時鑒定HPA兩個系統(tǒng)的等位基因，比FRET探針法更有優(yōu)勢。但是其需要特殊的熔解分析儀以及一種特殊的DNA熒光染料。16、PyrosequencingPyrosequencing是對短到中檔長度的DNA序列樣品進(jìn)行高通量的、精確和重復(fù)性好的分析的技術(shù)。第一步——測序引物和PCR擴(kuò)增的、單鏈的DNA模板雜交，與酶—DNA聚合酶（DNApolymerase）、ATP硫酸化酶（ATPsulfurylase）、熒光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine5′phosphosulfate(APS)、熒光素（luciferin）孵育。第二步——四種dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反映體系，如與模板配對（A—T，C—G），此dNTP與引物的末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來。注意：反映時deoxyadenosinealfa-thiotriphosphate(dATPS)是dATP的替代物，由于DNA聚合酶對dATPS的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATPS不是熒光素酶的底物。第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的狀況下催化焦磷酸形成ATP，ATP驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素（oxyluciferin）的轉(zhuǎn)化，氧化熒光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。ATPsulfurylasePPi+APS—————————>ATPLuciferase，ATPLuciferin—————————>oxyluciferin光信號由CCD攝像機(jī)檢測并由軟件pyrogram?反映為峰。每個光信號的峰高與反映中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第四步——ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反映體系。第五步——然后加入下一種dNTP。在以上環(huán)節(jié)循環(huán)進(jìn)行中，互補(bǔ)DNA鏈合成，序列從pyrogram?的信號峰中決定。運(yùn)用PSQ96系統(tǒng)進(jìn)行測序分析可盼望得到20-30個堿基的讀序長度，但是和任何測序技術(shù)同樣，最大讀序長度取決于模板的二級構(gòu)造、堿基構(gòu)成、PCR產(chǎn)物質(zhì)量和其它參數(shù)。最佳化的PyrosequencingPyrosequencing反映運(yùn)用的是酶級連系統(tǒng)，簡樸且強(qiáng)有力，給出陽性或陰性成果，每種成分和參數(shù)已最佳化，以得到高度一致的成果，精確度為99%。*底物濃度已最佳化*選擇了Apyrase的特異濃度，確保了全部的dNTP被降解，涉及ATP和dATPS*dNTP降解速率慢于摻入速率，有助于dNTP充足摻入*ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP濃度和光產(chǎn)生正比于摻入的dNTP數(shù)目*認(rèn)真控制的試劑，確保了足夠的活性和質(zhì)量待測序模扳制備通過PCR技術(shù)將待測序列擴(kuò)增，其中引物之一在合成時用生物素標(biāo)記。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于擴(kuò)增的DNA中，DNA分子通過引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成復(fù)合體。DNA變性后，帶生物素標(biāo)記引物的單鏈在磁場中得到純化，然后就可用于與測序引物退火，方便進(jìn)行測序反映。PSQ96系統(tǒng)系統(tǒng)工作流程1,基因組DNA提取2,設(shè)計(jì)和合成PCR引物，其中之一標(biāo)記生物素;PCR反映3，DNA雙鏈的分離，含生物素的單鏈DNA與測序引物的退火4，對含生物素的單鏈DNA的測序/基于測序的SNP分析及等位基因頻率擬定PSQ96系統(tǒng)包含了進(jìn)行上述工作（3-4）的儀器及配件、軟件、試劑，系統(tǒng)的設(shè)計(jì)滿足高通量、快速、精確和經(jīng)濟(jì)的規(guī)定。Pyrosequencing技術(shù)的突出優(yōu)勢在于Pooling，合用于大規(guī)模的等位基因頻率分析，但需要特殊的儀器，硬件成本高；17、等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)（allele-specificPCR或amplification,ASPCR或ASA）ASPCR是一項(xiàng)在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新辦法，通過PCR和凝膠電泳即可檢測出DNA中多個點(diǎn)突變。ASPCR的基本構(gòu)思是設(shè)計(jì)2個ASO引物，使之與另一引物構(gòu)成PCR反映體系。這2個引物與探針的ASO不同，等位基因特異性堿基不是位于ASO中間，而是置于引物的3′端。這種設(shè)計(jì)是基于耐熱TaqDNA聚合酶缺少3′→5外切校正活性的特點(diǎn)。引物3′端的特異堿基分別互補(bǔ)于野生型和突變型等位基因的相對堿基，若此堿基對形成錯配，鏈延伸反映就會因3′,5-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻，故此法又稱擴(kuò)增受阻突變體系（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）。其擴(kuò)增成果為：“野生”模板妨礙,“突變”引物放大；或“突變”模板妨礙,“野生”引物放大。ASPCR點(diǎn)突變的檢出率依賴于反映條件的優(yōu)化和避免引物與靶DNA錯配時可能發(fā)生的錯配延伸，這可通過調(diào)