第九章-核酸分子雜交

核酸分子雜交技術(shù)

NucleicAcidMolecularHybridization主講內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術(shù)一、DNA的變性（denaturation）變性：在一定的條件下，DNA雙螺旋之間的氫鍵斷裂，解離成兩條無規(guī)則的卷曲狀單鏈DNA分子，此現(xiàn)象稱為變性。復(fù)性：去除變性因素后，單鏈DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則重新結(jié)合成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。二、DNA的復(fù)性(renaturation)退火淬火

根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成異源雙鏈雜交體的過程。三、核酸分子雜交雜交的基礎(chǔ)：核酸分子單鏈之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)。注：分子雜交可以在DNA與DNA、RNA與RNA、RNA與DNA的兩條單鏈之間進(jìn)行。

核酸分子的濃度溫度離子強(qiáng)度核酸分子的復(fù)雜性

影響核酸分子雜交的因素四、核酸分子雜交技術(shù)

通過標(biāo)記的單鏈核酸探針與固相支持物上或液相中單鏈的互補(bǔ)靶序列退火形成雙鏈雜交體，而定性或定量檢測(cè)特異DNA或RNA的技術(shù)。

第二節(jié)核酸探針

核酸探針的概念

核酸探針的類型

核酸探針的標(biāo)記

核酸探針的檢測(cè)方法

核酸探針(nucleicprobe)：指能夠與待測(cè)的靶核酸片段互補(bǔ)結(jié)合的帶有特殊可檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸片段。一、概念按化學(xué)本質(zhì)分：DNA探針

RNA探針按標(biāo)記物分：放射性標(biāo)記探針非放射性標(biāo)記探針按分子大小分：寡核苷酸探針單鏈探針雙鏈探針二、核酸探針的類型二、常見核酸探針1.基因組DNA探針

2.cDNA探針

3.RNA探針4.寡核苷酸探針來源于某種生物的基因組，為某一基因的全部或部分序列。來源于cDNA,不含有內(nèi)含子序列，適用于基因表達(dá)研究。大多以單鏈形式存在,雜交效率高。可通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得。用化學(xué)合成技術(shù)在體外合成的單鏈DNA,長度一般為20-50bp。三、核酸探針的標(biāo)記

1.核酸探針的標(biāo)記物（1）放射性核素標(biāo)記物常用放射性核素標(biāo)記物有：32P、35S、3H優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度極高,可檢測(cè)到10-14～10-18g的物質(zhì)，在最適條件下，可以測(cè)出樣品中少于1000個(gè)分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定10-9g的物質(zhì)。②對(duì)堿基配對(duì)的特異性和穩(wěn)定性無影響。③特異性高。缺點(diǎn)：放射性污染，有半衰期。32P或35S同位素標(biāo)記的單核苷酸（α）（γ）（OH）HOH(2)非放射性標(biāo)記物優(yōu)點(diǎn)：無放射性污染，穩(wěn)定性好，可以較長時(shí)間存放，處理方便。缺點(diǎn)：靈敏度、特異性不夠理想。常用非放射性標(biāo)記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素2.核酸探針的標(biāo)記方法（一）酶促法缺口平移法隨機(jī)引物法DNA探針末端標(biāo)記法（二）化學(xué)法預(yù)先標(biāo)記酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)移探針（1）缺口平移法（nicktranslation）

由DNA酶Ⅰ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。酶促法隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的六核苷酸片段的混合物。（2）隨機(jī)引物法（randompriming）酶促法

在5’或3’端通過酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端標(biāo)記法T4多核苷酸激酶5’末端標(biāo)記法聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記DNA探針RNA探針的標(biāo)記寡核苷酸鏈探針的標(biāo)記（3）探針的末端標(biāo)記酶促法Ⅰ

DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端標(biāo)記法限制性內(nèi)切酶酶促法ⅡT4多核苷酸激酶5’末端標(biāo)記法ATPADPγ32PT4多核苷酸激酶堿性磷酸酶酶促法1.生物素地高辛標(biāo)記核酸探針2.酶、熒光素標(biāo)記核酸探針化學(xué)法生物素化核苷酸①生物素(biotin)標(biāo)記生物素-16-dUTP

光敏生物素標(biāo)記法強(qiáng)光10-20分鐘

光敏生物素的結(jié)構(gòu)②

地高辛(digoxigenin)標(biāo)記Dig-11-dUTP的結(jié)構(gòu)③

酶標(biāo)記堿性磷酸酶辣根過氧化物酶④熒光素標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結(jié)合四、核酸探針的檢測(cè)

核酸分子雜交反應(yīng)完成后，必須使已標(biāo)記的核酸探針顯示出可檢測(cè)信號(hào)，方能檢測(cè)未知的待測(cè)核酸序列。

1.放射性同位素標(biāo)記探針的檢測(cè)

2.非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè)1.放射性同位素標(biāo)記探針的檢測(cè)（1）放射自顯影：利用放射線在X線底片的成影作用來檢測(cè)雜交信號(hào)。（2）液體閃爍計(jì)數(shù)器：2.非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè)（1）直接檢測(cè)：雜交反應(yīng)后可以立刻觀測(cè)結(jié)果。如酶和熒光素直接標(biāo)記的探針。（2）間接檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)果不