第三章 常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

第三章常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)光譜分析技術(shù)分光光度技術(shù)的基本原理分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的操作方法分光光度技術(shù)的定性和定量方法按波長(zhǎng)區(qū)域分1、紫外光譜：波長(zhǎng)范圍：200—400nm2、可見(jiàn)光譜：波長(zhǎng)范圍：400—760nm3、紅外光譜：波長(zhǎng)范圍：760—1000nm200—------400—---------760—---1000nm紫外譜光可見(jiàn)光譜紅外光譜光譜分析技術(shù)：利用物質(zhì)的吸收光譜、發(fā)射光譜、散射光譜特征對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的技術(shù)。吸收光譜（absorptionspectrum）即物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度不同而產(chǎn)生的光譜。發(fā)射光譜是由物質(zhì)分子或原子吸收了外來(lái)的能量后發(fā)生分子或原子間的能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的光譜。分類(lèi)吸收光譜分析法：1、可見(jiàn)分光光度法、測(cè)定有色物質(zhì)2、紫外分光光度法、測(cè)定無(wú)色物質(zhì)3、紅外分光光度法、測(cè)定物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)射光譜分析法1、火焰光度法、測(cè)定離子2、熒光法散射光譜分析法比濁法彩虹，又稱(chēng)天虹，簡(jiǎn)稱(chēng)虹，是氣象中的一種光學(xué)現(xiàn)象，當(dāng)太陽(yáng)光照射到半空中的水滴，光線(xiàn)被折射及反射，在天空上形成拱形的七彩的光譜，彩虹的七彩顏色究竟是哪七種有不同的說(shuō)法，東亞、中國(guó)對(duì)於七色光來(lái)說(shuō)最普遍的說(shuō)法是（從外至內(nèi)）：紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫或紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫，而西方常用的排色則為后者去掉靛色而成為六色。一、分光光度技術(shù)的基本原理（一）、光的吸收現(xiàn)象和吸收曲線(xiàn)互補(bǔ)色光：兩種顏色的光，按適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度、比例混合后可成為白色的光，這兩種色光成為互補(bǔ)色光。朗伯-比爾定律：

I0：入射光強(qiáng)度C:溶液濃度

b:液層厚度I:透射光強(qiáng)度

T:透光度A:吸光度

k:吸光系數(shù)bI0I（二）、光吸收定律三、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)最常用的是可見(jiàn)分光光度計(jì)和紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)

光源單色器比色杯檢測(cè)器顯示器五大部份結(jié)構(gòu)：（一）光源光源定義：指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的變化。光源種類(lèi)：可見(jiàn)光分光光度計(jì)常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。

紫外光光度計(jì)常用氫燈作為光源。（二）單色器定義：將來(lái)自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱(chēng)為分光系統(tǒng)或單色器。種類(lèi)：濾光片棱鏡光柵（三）比色杯又稱(chēng)為吸收池或比色皿材料：常用無(wú)色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成

（五）顯示器（四）檢測(cè)器檢測(cè)器是將透過(guò)溶液的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并將電信號(hào)放大的裝置。常用的檢測(cè)器為光電管和光電倍增管。是將光電管或光電倍增管放大的電流通過(guò)儀表顯示出來(lái)的裝置。721可見(jiàn)分光光度計(jì)

722系列可見(jiàn)分光光度計(jì)

SP-756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TENSOR系列紅外光譜儀

四、分光光度技術(shù)的定量測(cè)定方法測(cè)定原理1.物質(zhì)對(duì)光線(xiàn)有選擇性吸收作用。2.每種物質(zhì)都具有其特征性的吸收光譜。3.在一定條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收程度與該物質(zhì)的濃度成正比。

（一）對(duì)比法（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法）

實(shí)際測(cè)定過(guò)程中，用一已知濃度的測(cè)定物按測(cè)定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據(jù)前式計(jì)算。A標(biāo)準(zhǔn)=ε標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)L標(biāo)準(zhǔn)

A樣品=ε樣品C樣品L樣品

A：吸光度；ε：摩爾吸光度；C：溶液濃度；L：液層厚度因標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液中溶質(zhì)為同一物質(zhì)，

ε樣品=ε標(biāo)準(zhǔn)因盛標(biāo)準(zhǔn)液和測(cè)定液的比色杯徑長(zhǎng)相同L樣品=L標(biāo)準(zhǔn)故上二式可寫(xiě)成：A標(biāo)準(zhǔn)/A樣品=ε標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)/ε樣品C樣品

C樣品=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

配制一系列已知不同濃度的測(cè)定物溶液，按測(cè)定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，在方格座標(biāo)紙上作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)測(cè)得吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀得測(cè)定物的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)使用注意事項(xiàng)①標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍在測(cè)定濃度的一半到二倍之間。②吸光度在0.05-1.0范圍內(nèi)。③所作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)僅供短期使用。④標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作與測(cè)定管測(cè)定應(yīng)在同一臺(tái)儀器上進(jìn)行，避免誤差產(chǎn)生。應(yīng)用中注意的問(wèn)題①Lambert-beer’slaw的偏離：該定律只適應(yīng)于一定濃度范圍，稀溶液能很好的服從該定律，A宜在0.05～1.0之間，超過(guò)該范圍→偏離→計(jì)算結(jié)果與實(shí)際濃度不相符②選擇波長(zhǎng)：最大吸收波長(zhǎng)，因?yàn)閍.靈敏；b.避免雜質(zhì)干擾③參比溶液（空白管）：消除背景效應(yīng)，應(yīng)包含除待測(cè)溶質(zhì)以外所有的成分。

空白管：

測(cè)量過(guò)程中，因比色皿本身和溶劑也會(huì)產(chǎn)生一定的光吸收，故設(shè)置一個(gè)空白管，即其中除了待測(cè)溶質(zhì)以外，其它的成分完全相同。測(cè)量時(shí)，首先以空白管對(duì)準(zhǔn)光路對(duì)儀器調(diào)零，既消除比色皿本身對(duì)光的吸收，又消除了非待測(cè)物對(duì)光的吸收，所測(cè)值即為待測(cè)物造成的光吸收?；鹧婀舛确ǖ亩x火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量被測(cè)元素所發(fā)射的輻射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定量分析的方法。它是一種簡(jiǎn)化的發(fā)射光譜分析法。

火焰光度分析法火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量被測(cè)元素所發(fā)射的輻射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定量分析的方法。它是一種簡(jiǎn)化的發(fā)射光譜分析法。特點(diǎn)①快速：試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測(cè)定。②準(zhǔn)確：火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為2％~5％，可用于微量分析和常量分析。③靈敏：分析堿金屬與堿土金屬，絕對(duì)靈敏度可達(dá)0．1～10×10－6g。④設(shè)備簡(jiǎn)單：被測(cè)試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線(xiàn)較簡(jiǎn)單，且均在可見(jiàn)光區(qū)，故使譜線(xiàn)分離和測(cè)量的設(shè)備簡(jiǎn)單。⑤應(yīng)用范圍窄：主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測(cè)定。儀器裝置（1）FP640火焰光度計(jì)

火焰光度法分析示意圖1.光源系統(tǒng)2.光學(xué)系統(tǒng)3.檢測(cè)系統(tǒng)（一）、基本原理火焰光度法的定量原理與發(fā)射光譜相同。即：試樣