第五章 酶的非水相催化 to 學(xué)生

第五章非水相生物催化1酶的非水相催化體系有機(jī)介質(zhì)中的酶催化：1、微水有機(jī)介質(zhì)體系、2、與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系、3、膠束和反膠束體系；氣相介質(zhì)中的酶催化體系超臨界流體介質(zhì)中的酶催化體系離子液介質(zhì)中的酶催化體系2有機(jī)介質(zhì)中的酶催化1、微水有機(jī)介質(zhì)：由有機(jī)溶劑和微量的水組成的反應(yīng)體系。微量的水主要是酶分子的結(jié)合水，它對(duì)維持酶分子的空間構(gòu)象和催化活性至關(guān)重要。另外一部分水分布在有機(jī)溶劑中。2、與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系：由水和極性較大的有機(jī)溶劑互溶組成的反應(yīng)體系，水和溶劑含量均較大，酶和底物以溶解狀態(tài)存在于均一體系。33、膠束和反膠束體系：膠束又稱(chēng)正膠束或正膠團(tuán)，是在大量水溶液中含有少量與水不相混溶的有機(jī)溶劑，加入表面活性劑后形成的”水包油”型的微小液滴。反應(yīng)時(shí)，酶在膠束外面的水溶液中，疏水性的底物或產(chǎn)物在膠束的內(nèi)部。反應(yīng)在膠束的兩相界面中進(jìn)行。4反膠束反膠束又稱(chēng)反膠團(tuán)，在大量與水不相混溶的有機(jī)溶劑中，含有少量的水溶液，加入表面活性劑后形成的”油包水”型的微小液滴。催化反應(yīng)在兩相的界面中進(jìn)行。在反膠束體系中，由于酶分子處于反膠束內(nèi)部的水溶液中，穩(wěn)定性較好。5氣相介質(zhì)中的酶催化體系氣相介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)是指酶在氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。氣體介質(zhì)密度低，擴(kuò)散容易。6超臨界流體介質(zhì)中的酶催化體系

超臨界流體:溫度和壓力均在本身的臨界點(diǎn)以上的高密度流體，具有和液體同樣的凝聚力、溶解力；擴(kuò)散系數(shù)又接近于氣體，是通常液體的近百倍。7超臨界流體的有關(guān)性質(zhì)（P-V-T）流體名稱(chēng)乙烷丙烷丁烷戊烷乙烯氨CO2二氧化硫水臨界溫度（℃）32.396.9150.0296.79.9132.431.1157.6374.3臨界壓力（Mpa）4.263.83.385.1211.287.387.8822.114.88臨界密度(g/cm3)0.2200.2280.2320.2270.2360.4600.5250.3260.203如：純凈的CO2被加熱或壓縮到高于其臨界點(diǎn)（臨界溫度31.1℃，臨界壓力7.28Mpa)時(shí)的狀態(tài)。該流體具有無(wú)毒、無(wú)臭、不燃等優(yōu)點(diǎn)。8超臨界酶催化的特點(diǎn)流體對(duì)酶結(jié)構(gòu)無(wú)破壞作用；良好的化學(xué)穩(wěn)定性；對(duì)設(shè)備無(wú)腐蝕作用；超臨界溫度最宜在室溫或酶的適宜催化溫度；超臨界壓力不宜太高，節(jié)約壓縮動(dòng)力費(fèi)用。9離子液介質(zhì)中的酶催化體系離子液體：由體積相對(duì)較大、不對(duì)稱(chēng)的有機(jī)陽(yáng)離子和體積相對(duì)較小的無(wú)機(jī)陰離子組合而成的物質(zhì)，又稱(chēng)液體熔鹽?！傲恪闭羝麎?、非揮發(fā)性、低熔點(diǎn)（<100C）、寬液程、高熱穩(wěn)定性、良好的透光性等優(yōu)點(diǎn)。能提高酶的活性和選擇性、提高酶的熱穩(wěn)定性。10非水相介質(zhì)(有機(jī)相)中的酶學(xué)性質(zhì)1、酶在有機(jī)溶劑中之所以能發(fā)揮催化功能是因?yàn)樵谟袡C(jī)溶劑體系中能夠保持整體結(jié)構(gòu)和活性中心的完整性。2、有機(jī)溶劑在很大程度上也會(huì)影響酶的穩(wěn)定性和酶底物的特異性。3、由于有機(jī)溶劑改變了疏水相互作用間的精細(xì)平衡，從而影響酶的結(jié)合部位，改變了底物的存在狀態(tài)，使得自由能改變，影響酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性和催化功能等。111.非水相介質(zhì)中酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)證明：有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性都比水溶液中高。例如：豬胰脂肪酶(PPL)在苯中催化脂交換反應(yīng)。有機(jī)相中100C半衰期10h以上，而在水相中100C馬上失活。原因：有機(jī)溶劑中缺少使酶失活的水分子，而水會(huì)引起酶分子中一些氨基酸的脫氨基、水解、二硫健的破壞、半胱氨酸的氧化、AA異構(gòu)化等蛋白質(zhì)熱失活使得熱不穩(wěn)定。12有機(jī)介質(zhì)中酶熱穩(wěn)定性提高：酶結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)和水含量有限。水溶液中，酶分子親水區(qū)位于酶表面，官能團(tuán)與水溶液的水分子形成氫鍵，使蛋白質(zhì)具有“柔性”的開(kāi)放結(jié)構(gòu)；有機(jī)介質(zhì)中，酶的疏水區(qū)暴露出來(lái)，帶電基團(tuán)的相互作用是酶蛋白活性的“封閉”構(gòu)象，酶分子的剛性增強(qiáng)，對(duì)受熱而引起起的折疊抗性增強(qiáng)，熱穩(wěn)定性提高。水是酶分子變性的主要參與者，含水量的減少會(huì)使變性受到抑制，從而提高酶的熱穩(wěn)定性。132.非水相中酶的底物特異性（1/2）酶與底物的特異性結(jié)合取決于：酶-底物結(jié)合能和酶、底物及溶劑相互作用能的能差，因此酶與底物的結(jié)合受溶劑的影響：如凝乳蛋白酶催化N-乙酰AA酯水解反應(yīng)(AA:疏水的苯丙氨酸/親水的絲氨酸)：水溶液中，苯丙氨酸乙酰酯的水解速度是絲氨酸乙酰酯的5X104倍，辛烷中，絲氨酸酯的水解速度快3倍。原因：水溶液中，酶與底物的結(jié)合主要是疏水作用，有機(jī)相中，這種疏水作用已不重要。酶能夠利用與底物結(jié)合的自由能來(lái)加速反應(yīng)，總的結(jié)合能的變化是酶-底物結(jié)合能和酶-水分子結(jié)合能的差值。因此，介質(zhì)改變時(shí)，酶的底物專(zhuān)一性（Kcat/Km）和催化效率會(huì)發(fā)生改變。142.非水相中酶的底物特異性（2/2）另一方面，底物/反應(yīng)介質(zhì)與酶活性中心之間分配的變化，也是影響酶的底物專(zhuān)一性及催化效率的因素之一，而底物和介質(zhì)的疏水性直接影響底物在兩者之間的分配。153.非水相酶的對(duì)映選擇性（1/2）（1）.酶的對(duì)映選擇性使指酶識(shí)別外消旋化合物中某種構(gòu)象對(duì)映體的能力，這種選擇性是由于酶和兩種對(duì)映體形成復(fù)合物的能量差造成的。（2）.有機(jī)溶劑中酶對(duì)底物的對(duì)映體選擇性隨著介質(zhì)的親、疏水性的變化而變化。有機(jī)溶劑中酶的立體選擇性降低是由于底物的兩種對(duì)映體把水分子從酶分子的疏水結(jié)合位點(diǎn)置換出來(lái)的能力不同。總的結(jié)果是酶的立體選擇性隨介質(zhì)疏水性增加而降低。

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3.非水相酶的對(duì)映選擇性（2/2）（3）.溶劑的幾何形狀也影響酶的對(duì)映體選擇性。一般來(lái)講增加體系的水含量會(huì)提高酶的對(duì)映體選擇性。因?yàn)樵黾芋w系水含量，在某種程度上會(huì)使酶恢復(fù)其天然構(gòu)相，快反應(yīng)與慢反應(yīng)的速度差加大，從而提高酶得映體選擇性。174.非水相酶的位置選擇性有機(jī)溶劑中的位置選擇性即：酶介質(zhì)能夠選擇性的催化底物中某個(gè)區(qū)域的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。一些反應(yīng)說(shuō)明：脂肪酶催化脂交換反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)位置選擇因子（Kcat/Km)與溶劑的疏水性常數(shù)lgP有較好的相關(guān)性。185.非水相酶的化學(xué)鍵選擇性化學(xué)鍵的選擇性也是非水介質(zhì)中酶催化的一個(gè)顯著特點(diǎn)，一些實(shí)驗(yàn)證明：酶的化學(xué)鍵選擇性與氫鍵參數(shù)有關(guān)。利于形成氫鍵的基團(tuán)不利于親核進(jìn)攻，不利于形成氫鍵的，有利于親核進(jìn)攻，進(jìn)行催化反應(yīng)。19pH值特性水溶液中，pH決定酶分子活性中心基團(tuán)和底物分子的解離狀態(tài)，影響酶與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)；有機(jī)介質(zhì)，無(wú)質(zhì)子的獲得或丟失，pH和催化反應(yīng)？pH記憶或印記：有機(jī)介質(zhì)中，酶所處的pH環(huán)境與酶在凍干或吸附在載體之前所使用的緩沖溶液pH制相同。酶分子在緩沖溶液中所處的pH狀態(tài)被保留在有機(jī)介質(zhì)中?？刂凭彌_溶液pH值，控制有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)的最適pH范圍。206.PH記憶和PH忘記（1/2）有機(jī)溶劑中的酶能夠“記憶”它凍冰干燥或丙酮沉返前所在緩沖溶液的PH值和離子強(qiáng)度密切相關(guān)，成為“PH記憶”。其最適PH于水相中的最適PH時(shí)一致的。原因：緩沖液中酶的解離取決于環(huán)境，有機(jī)相中酶不存在質(zhì)子化和去質(zhì)子化的條件，酶從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相時(shí)，保持了原有的離子化狀態(tài)，有機(jī)相環(huán)境不能改變這種解離狀態(tài)。利用酶的這種特性可以控制有機(jī)相中酶催化的最適PH值。216.PH記憶和PH忘記（2/2）隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑中的酶的最適PH與水溶液中相差較大，有機(jī)溶劑中酶活力不僅和冷凍干燥前緩沖溶液的PH相關(guān)，卻與緩沖液的種類(lèi)和離子強(qiáng)度、有機(jī)相中的水含量相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)微水有機(jī)溶劑中疏水性的酸或堿與他們相應(yīng)的鹽組成的混合物，可作為有機(jī)相緩沖液（organicphasebuffer）,他們以中性或離子對(duì)形式能夠充分溶于有機(jī)相，而不能進(jìn)入水或其他極性溶液。這兩種存在形式的比例控制著有機(jī)相中酶的解離狀態(tài)，使酶完全忘記干燥前他所處的水溶液的PH值。這就是“PH忘記”．22酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，水是不可缺少的成分之一。有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少對(duì)酶的空間構(gòu)象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。有機(jī)相中水對(duì)酶催化活性的影響23一個(gè)典型的非水相酶體系中水的含量?jī)H占0.01%，水含量微小的差別會(huì)導(dǎo)致酶催化活性的較大改變。酶需要少量的水保持活性的三維構(gòu)象狀態(tài)，水影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，活性位點(diǎn)的極性和穩(wěn)定性。酶周?chē)拇嬖?，能降低酶分子的極性氨基酸的相互作用，防止產(chǎn)生不正確的二級(jí)構(gòu)象結(jié)構(gòu)。24必需水酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無(wú)水的條件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。因此，酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構(gòu)象。維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱(chēng)為必需水（essentialwater）。25酶周?chē)乃瘜幼鳛槊副砻婧头磻?yīng)介質(zhì)之間的緩沖劑，是酶微環(huán)境的主要成份，有機(jī)溶劑與酶鍵合水(結(jié)合水)之間的相互作用影響了酶的活力，當(dāng)加入許多極性添加劑時(shí)，因剝奪了酶的水化層而使非水介質(zhì)中的酶失活。在一個(gè)完全“干”的體系中，酶基本是無(wú)活性的，隨著酶水合程度的增加，酶的活性也不斷提高。26必需水與酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有密切關(guān)系。不同的酶，所要求的必需水的量差別很大。如每分子凝乳蛋白酶５０分子必需水，每分子多酚氧化酶3.5×102。因?yàn)楸匦杷蔷S持酶分子結(jié)構(gòu)中氫鍵、鹽鍵等副鍵所必需的，而氫鍵和鹽鍵又是酶空間結(jié)構(gòu)的主要穩(wěn)定因素。酶分子失去水，空間構(gòu)象和催化能力受破壞。有機(jī)介質(zhì)中，通過(guò)必需水的調(diào)控，可調(diào)控酶的催化活性和選擇性。27有機(jī)溶劑中的水分和水活度體系中，水在溶劑、酶、底物和產(chǎn)物之間分配，含水量分布在酶、溶劑、固定化載體及雜質(zhì)中。與酶緊密鍵合的結(jié)合水是決定酶活力的關(guān)鍵因素。在結(jié)合水不變的情況下，體系中水含量的變化對(duì)酶的催化活性影響不大。對(duì)同一種酶，系統(tǒng)的最適水含量與溶劑的種類(lèi)、酶的純度、載體性質(zhì)和修飾劑等多因素相關(guān)。28有機(jī)相中含水量與酶活力Zaks和Klibanov研究了多種酶在不同溶劑中水含量對(duì)酶活力的影響：催化活力隨溶劑中水含量的增加而增加；與親水性有機(jī)溶劑相比，在疏水性強(qiáng)的溶劑中酶表現(xiàn)最大活力所需