蔬菜中有機磷農(nóng)藥的殘留凈化及分離方法研究

蔬菜中有機磷農(nóng)藥的殘留凈化及分離方法研究

有機磷農(nóng)藥具有光譜效應(yīng)和高效化性等優(yōu)點。這是目前的三種農(nóng)藥之一。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，它在品種、數(shù)量和產(chǎn)量上達到了各種農(nóng)藥的1:1%。由于有機磷農(nóng)藥對細(xì)菌、害蟲、雜草生長等具有有效的控制作用和提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量而被廣泛使用,但有機磷農(nóng)藥使用過多,產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)也日益突顯,致使農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo),長期攝取含有機磷農(nóng)藥及代謝產(chǎn)物的農(nóng)作物會對人的健康造成較大影響［2］。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和各國在食品安全研究方面的突破,除了對原藥殘留進行檢測外,增加了對藥物殘留代謝產(chǎn)物的研究,并對其毒性較強的代謝產(chǎn)物進行檢測。有機磷農(nóng)藥降解產(chǎn)物往往具有較強毒性,如敵百蟲在一定條件下可迅速轉(zhuǎn)化成毒性更強的敵敵畏［3］,乙酰甲胺磷在環(huán)境中容易降解成甲胺磷［4］,甲基對硫磷等含有苯硝基類有機磷農(nóng)藥最主要的降解產(chǎn)物是對硝基酚［5］,馬拉硫磷代謝產(chǎn)物為中間體O,O-二甲基二硫代磷酸酯等［6］。我國在國家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2012中對蔬菜中各種有機磷農(nóng)藥的殘留限量有明確的規(guī)定,4種有機磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的殘留限量為0.02~8mg/kg(對硝基酚及O,O-二甲基二硫代磷酸酯沒有規(guī)定),美國及歐盟的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)與GB2763-2012所規(guī)定的限量基本一致［7］。有機磷農(nóng)藥的檢測方法主要有氣相色譜法［8］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［9］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11］及毛細(xì)管電泳法［12］等,前處理方法主要為液液萃取［8，11］、QuEChERS技術(shù)［10，13］、固相萃?。?，14］、固相微萃?。?5］等,但方法都局限于農(nóng)藥母體的檢測,很少關(guān)注農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的同時檢測,而部分有機磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物在食品中的殘留富集,對人體帶來的傷害甚至遠高于有機磷農(nóng)藥本身［4］。有機磷農(nóng)藥代謝物的檢測,若局限于某一種化合物或者是幾種可能代謝物的檢測,不具有針對性,不能作為有機磷農(nóng)藥的標(biāo)記物［16，17］。農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的檢測,對食品安全具有更重要的價值,可能是未來農(nóng)藥殘留檢測的熱點和難點。本文以菠菜和洋蔥為研究對象,用固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時檢測4種有機磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物,對農(nóng)藥殘留檢測的技術(shù)儲備及農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的研究具有重要意義。1實驗部分1.1試劑與標(biāo)準(zhǔn)品WatersACQUITYUltraPerformance液相色譜系統(tǒng),并配有溶劑管理器;WatersXEVOTQ三重四極桿質(zhì)譜儀(Waters公司);均質(zhì)機(T25,IKA公司);組織搗碎機(Philips公司);固相萃取裝置(Supelco公司)等。有機磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品:馬拉硫磷(malathion,純度99.5%,Fluka公司),O,O-二甲基二硫代磷酸酯(dimethyldithiophosphate,純度97%,維賽諾化學(xué)技術(shù)有限公司),甲基對硫磷(parathion-methyl,純度99.8%,Sigma公司),對硝基酚(4-ni-trophenol,純度99.5%,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),敵百蟲(trichlorfon,純度99.5%,Sigma公司),敵敵畏(dimethyldichlorovinyphosphate,DDVP,純度99.8%,Fluka公司),乙酰甲胺磷(acephate,純度99.5%,Fluka公司),甲胺磷(methamidophos,純度99.5%,Fluka公司)。標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解,于4℃冰箱中保存,使用時用流動相定容。500mg6mL活性炭固相萃取柱及500mg6mL弗羅里硅土固相萃取小柱均購自Supelco公司,其他試劑均為分析純試劑。1.2樣品的制備葉菜以菠菜為試驗樣本。提取:樣品用組織搗碎機處理后,稱取約5g(精確到0.01g)于50mL離心管中,加入2gMgSO4、20mL乙酸乙酯,均質(zhì)器均質(zhì)2min(不低于10000r/min),然后于4000r/min下離心5min,取上層清液。凈化:取10mL上層清液過500mg6mL活性炭和500mg6mL弗羅里硅土串聯(lián)小柱(小柱經(jīng)5mL乙酸乙酯活化處理),再用10mL乙酸乙酯洗脫小柱,合并流出液和上樣液,氮吹至近干,用1.0mL乙腈-5mmol/L乙酸銨水溶液(1∶1,v/v)溶解殘渣,待測定。其他色素含量較低的蔬菜以洋蔥為試驗樣本。提取方法與葉菜相同,凈化方法略有不同,10mL上層清液只經(jīng)過弗羅里硅土小柱,其他操作完全相同。1.3流動相和梯度洗脫程序色譜柱:ACQUITYUPLCBEHHILIC(50mm×2.1mm,1.7μm);柱溫:30℃。進樣器用強溶劑(30%乙腈水溶液)和弱溶劑(70%乙腈水溶液)清洗。流動相:溶劑A為乙腈,溶劑B為5mmol/L的乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序:0~1.0min,50%B;1.0~1.5min,50%B~70%B;1.5~2.0min,70%B;2.0~2.1min,70%B~50%B;2.1~3.0min,50%B。流速:0.25mL/min。1.4劑氣、霧無砂系統(tǒng)毛細(xì)管電壓:2.5kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑氣(N2)流速:650L/h;霧簾氣(N2)流速:50L/h;脫溶劑氣溫度:400℃;碰撞氣:氬氣。數(shù)據(jù)處理為MassLynxv4.1系統(tǒng)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。2結(jié)果與討論2.1反相凈化方式的確定有機磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物在乙酸乙酯、乙腈、丙酮及二氯甲烷等試劑中均有較好的溶解度,考慮到二氯甲烷對環(huán)境的污染及乳化問題,丙酮更適合于糧谷等物質(zhì)中的有機磷及代謝物提取,蔬菜通常采用乙腈和乙酸乙酯作提取試劑。葉菜類蔬菜由于多數(shù)色素含量較高,而乙腈對葉綠素、葉黃素及胡蘿卜素的提取效率高,提取液顏色較深,凈化效果不好;采用乙酸乙酯進行提取,色素含量較低,再用活性炭小柱除去殘留的色素,效果較為理想。試驗中選擇反相C18凈化小柱,將提取液濃縮后用含5%甲醇的乙酸銨溶液溶解過柱,由于O,O-二甲基二硫代磷酸酯及對硝基酚極性較強,柱保留效果不好,損失較大;采用正相凈化方式,用乙酸乙酯溶解,過氧化鋁小柱,對硝基酚的吸附作用較大,造成回收率不高;使用乙酸乙酯溶解,過弗羅里硅土小柱,凈化效果最佳,因而采用弗羅里硅土的正相取凈化方式。2.2o,o-二甲基二硫代磷酸酯和pfb-br衍生高效液相色譜法檢測傳統(tǒng)有機磷農(nóng)藥的檢測一般采用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法［8，9］,但在檢測O,O-二甲基二硫代磷酸酯及敵百蟲的過程中都遇到了一些問題［16］。O,O-二甲基二硫代磷酸酯和敵百蟲都是一種遇熱易分解的物質(zhì),實驗發(fā)現(xiàn),O,O-二甲基二硫代磷酸酯遇熱甲基化或分解成其他小分子化合物(見圖1),但轉(zhuǎn)化效率不高,速率較慢,因而色譜峰對稱性不好,峰形不尖銳,定量誤差較大。O,O-二甲基二硫代磷酸酯的檢測多采用五氟溴芐苯(PFB-Br)衍生,將羥基屏蔽以減小O,O-二甲基二硫代磷酸酯的活性,再進行氣化檢測的方式,但是衍生效率不高,且步驟較為繁瑣,也不利于多組分的同時檢測［16］。敵百蟲由于在高溫條件下C-P鍵易發(fā)生斷裂,分子重排后生成三氯乙醛和亞磷酸二甲酯,一般采用對亞磷酸二甲酯的檢測來確定敵百蟲的含量,但是敵百蟲的定量分解與溫度條件關(guān)系密切,只有在氣相色譜進樣口超過260℃時,定量分解才較為充分［18］。所以O(shè),O-二甲基二硫代磷酸酯和敵百蟲的檢測條件有一定的矛盾性,采用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用直接或衍生的檢測方法,都不利于多組分的同時檢測。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方式進行檢測,多數(shù)化合物效果較好,靈敏度高,且不需要衍生,但是O,O-二甲基二硫代磷酸酯和對硝基酚極性較強,保留弱,使用C18色譜柱不能滿足分離要求。試驗對色譜條件進行了優(yōu)化和選擇,使用ACQUITYUPLCBEHHILIC色譜柱進行分離,效果較好(見圖2)。以菠菜作為基質(zhì),對4種有機磷農(nóng)藥及其代謝物采用活性炭和弗羅里硅土串聯(lián)固相萃取小柱凈化后的絕對基質(zhì)效應(yīng)進行了考察,其基質(zhì)效應(yīng)都不高于45.1%(見表2),說明凈化效果及質(zhì)譜條件較為合理,有利于定量分析的準(zhǔn)確性。2.3加標(biāo)回收率測定在蔬菜(菠菜)中添加有機磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品進行回收率測定,每個水平測定6次,其加標(biāo)回收率為76.9%~102.8%,RSD為5.92%~10.19%(見表2),結(jié)果表明方法符合檢測要求。2.4濃度計的確定將8種標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,定量限采用在樣品處理后的基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)品的方式獲得,以至少大于10倍信噪比時的測得濃度計;以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算相關(guān)系數(shù),結(jié)果表明,在0.01~1.00mg/kg范圍內(nèi)均線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(見表3)均滿足檢測要求。2.5質(zhì)譜檢測結(jié)果試驗采用購自哈爾濱市農(nóng)貿(mào)市場的白菜、辣椒及西紅柿,每個品種均有兩個樣本,用建立的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法進行檢測,發(fā)現(xiàn)一個西紅柿樣本中檢測到2.3μg/kg的馬拉硫磷;一個辣椒樣本中檢測到1.2μg/kg的對硝基酚,但由于對硝基酚也可能為環(huán)境污染物,不能說明對硝基酚一定來自甲基對硫磷的降解。其他樣本均未檢出目標(biāo)農(nóng)藥及其代謝物。3色譜柱和色譜柱的選擇色素含量高的蔬菜前處理采用