隱球菌動物模型研究進(jìn)展

隱球菌動物模型研究進(jìn)展

動物模型在隱菌的研究中起著重要作用。它不僅是對留學(xué)生感染隱菌后病理生理、遺傳免疫等反應(yīng)的研究，也是對留學(xué)生感染后隱菌的生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)變化的重要手段。隱球菌可以從許多動物分離到,如鳥類、禽類、嚙齒類、靈長類等,其中部分如鴿類等并不處于疾病狀態(tài)。從一些昆蟲中也可分離到隱球菌,如蟑螂、木虱和螨蟲等。但由于不同動物的遺傳穩(wěn)定性、實驗重復(fù)性不同,并不是所有能夠引起感染的動物均可作為動物模型。1選擇適宜的實驗動物按遺傳控制方法的不同,根據(jù)基因純合的程度,一般可將實驗動物分為近交系、突變系、封閉群和雜交群4類。近交系在遺傳上具有高度純合性和穩(wěn)定性的純品系動物。封閉群繁殖率高、具有雜合的特性,適于大量繁殖,因此非常適用于生物制品、制藥行業(yè)中各種藥品的安全性和效價等對實驗動物需求量大的研究。研究目的不同,需要選擇不同類型的實驗動物。如研究隱球菌感染后引起宿主遺傳學(xué)特性或免疫學(xué)特性上的反應(yīng),一般需要選擇重復(fù)性強的近交系動物;若要評價新藥對隱球菌的作用,則需選擇可以大量繁殖的封閉群動物;若要研究宿主某特定基因?qū)﹄[球菌致病的作用,則需選擇某特定基因突變的突變系動物。隱球菌被歸為生物動物安全Ⅱ級病原菌,因此推薦在Ⅱ級生物安全柜中或具有相應(yīng)安全級別的實驗室中進(jìn)行隱球菌動物實驗。盡管環(huán)境中隱球菌播散于人類而引起致病的確切機制還不是十分清楚,然而研究人員仍需注意處理飼養(yǎng)動物的廢料以及飼養(yǎng)環(huán)境等的消毒。而有些動物模型尤其是肺部感染模型,如小鼠經(jīng)氣管內(nèi)吸入構(gòu)建的模型,可能使病原菌播散到空氣中而引起研究人員感染。因此免疫力低下的人員應(yīng)避免接觸。偶有研究人員被污染的注射器刺傷而引起局部皮膚感染的報道,都應(yīng)引起實驗操作人員的注意。出現(xiàn)這種情時應(yīng)及時預(yù)防性使用抗真菌藥物以避免局部感染或隱球菌擴散感染。2隱球形的致病性機制從19世紀(jì)后期開始,研究人員陸陸續(xù)續(xù)采用了一系列動物種群來研究隱球菌的致病機制。目前采用最多的是豚鼠、小鼠、大鼠和兔。這四種動物用于隱球菌感染模型構(gòu)建的優(yōu)缺點見表1。2.1動物感染模型的構(gòu)建豚鼠(Guineapig,Caviaporcellus),又名豚豬、天竺鼠、荷蘭豬,是最早被用于研究隱球菌感染的動物模型,同時它也被廣泛應(yīng)用于其他侵襲性真菌感染動物模型的研究,如接合菌病、曲霉病、念珠菌病等。豚鼠的隱球菌感染實驗動物模型主要通過靜脈注射、腹腔注射和氣管吸入病原菌的方法構(gòu)建。靜脈注射構(gòu)建豚鼠系統(tǒng)性隱球菌感染一般需采用的病原菌為103～105數(shù)量級。有人采用新生隱球菌B42419株來構(gòu)建隱球菌豚鼠感染模型,注射菌量為200CFU/g體重,成功地使豚鼠的大腦、淋巴結(jié)、肌肉及皮膚產(chǎn)生感染表現(xiàn)。采用腹腔注射的方法來構(gòu)建隱球菌豚鼠感染模型需病原菌量達(dá)到105～107。腹腔注射高濃度的新生隱球菌(107CFU)可使豚鼠發(fā)生肺部和腦部感染,并有不同程度的脾臟、肝臟和腎臟的感染。而氣管吸入的方法構(gòu)建豚鼠隱球菌感染模型所需菌量不低于103,該方法比較常用,但也存在著麻醉深度的問題。麻醉太淺可能導(dǎo)致病原菌“吃”入消化系統(tǒng)而“吸入”相對較少,而麻醉太深則可導(dǎo)致實驗動物無法“吸入”病原菌。不過,總體來說,用氣管吸入法來構(gòu)建隱球菌動物感染模型相對比較方便。有研究顯示相同的新生隱球菌菌株通過呼吸道接種,豚鼠比大鼠對感染更具抵抗力。但Bulmer等用(1.5～17)×107CFU的無莢膜新生隱球菌經(jīng)氣管吸入的方法構(gòu)建模型,6h后殺死動物,仍可在肺部培養(yǎng)到新生隱球菌,這說明豚鼠的肺泡巨噬細(xì)胞并不能有效殺滅新生隱球菌。與人類一樣,雌性豚鼠比雄性豚鼠對隱球菌更具抵抗力,所以在構(gòu)建動物模型時要注意不同性別的豚鼠給菌量需做一定的調(diào)整。豚鼠作為實驗動物模型的優(yōu)點是溫順,便于各種實驗操作。而缺點是豚鼠的近交品系少,不利于分析宿主對隱球菌的反應(yīng);可用于豚鼠相應(yīng)研究的免疫學(xué)試劑少,不利于分析各種免疫因素對隱球菌的影響。2.2免疫抑制預(yù)處理兔,即家兔(domesticrabbit,Oryctolaguscuniculus),在早期研究中,因為兔的睪丸部位溫度較低,因而可接種產(chǎn)生隱球菌病,但由于該模型不能反應(yīng)自然感染的傳播途徑,所以臨床意義很小。兔因其體型和腦容量相對較大,因此常用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染動物模型的研究。它相對其他常用動物模型的一個優(yōu)點是可以在實驗中多次收集腦脊液的菌體,有利于連續(xù)觀察和研究病原菌的反應(yīng)。兔的腦脊液總共約8mL,每次可采集1mL而不會影響兔的正常生存。兔中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染動物模型的構(gòu)建可通過直接腦池注射的方法來實現(xiàn)。在構(gòu)建兔中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染前需采用糖皮質(zhì)類固醇激素進(jìn)行免疫抑制預(yù)處理。在臨床上,兔隱球菌感染模型的致病狀態(tài)與糖皮質(zhì)類固醇的用量明顯相關(guān),因此在構(gòu)建模型時所采用的糖皮質(zhì)激素的用量需進(jìn)行一定的摸索。采用這種方法構(gòu)建動物模型有一個重要的問題就是動物麻醉。由于兔對麻醉劑非常敏感,因此麻醉劑的用量需個體化。兔處于麻醉狀態(tài)時其呼吸道容易收縮而導(dǎo)致窒息,在實驗中應(yīng)予以重視。一般可采用氯胺酮或氯胺酮、賽拉嗪和乙酰丙嗪的混合物或異氟醚氣管吸入的方法。麻醉后用細(xì)針將制備好的病原菌液注射入腦池。一般需要大劑量接種(>106CFU)才能致病。由于不同隱球菌菌株的毒力也不同,因此接種的菌量需進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。兔也用于眼部隱球菌感染模型和皮膚感染模型的研究,但相對較少。直接給兔皮內(nèi)接種隱球菌能產(chǎn)生皮膚損害,皮損大小與接種量的多少相關(guān),且近30%的動物模型中,損傷從皮膚向其他部位播散。兔隱球菌動物感染模型的優(yōu)點是需要進(jìn)行免疫抑制處理,這與人類感染隱球菌的條件相類似;兔的體重較大使某些體液如腦脊液的重復(fù)取樣成為可能,這不僅有利于研究致病狀態(tài)下的病原菌各種生物學(xué)、遺傳學(xué)的特征,也有利于藥物治療的研究。例如兔模型在治療隱球菌性腦膜炎時應(yīng)用兩性霉素B比現(xiàn)今使用的唑類藥物能產(chǎn)生更為快速的腦脊液菌體轉(zhuǎn)陰。盡管與人一樣,該模型腦脊液中兩性霉素B和伊曲康唑含量極低,但這兩種藥物仍舊是兔和人類隱球菌性腦膜炎治療的有效藥物。該模型也有效地用來在動力學(xué)上研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的宿主反應(yīng),包括體液免疫、趨化因子和腦脊液細(xì)胞類型及它們的活化等。兔隱球菌感染模型的缺點包括動物飼養(yǎng)費用高、可使用的近交品系極少而不利于研究隱球菌感染后動物的遺傳學(xué)特征、缺乏相應(yīng)的免疫試劑使宿主對病原菌的免疫反應(yīng)研究困難重重、在構(gòu)建模型時需要免疫抑制使操作更為復(fù)雜、感染的非自然途徑(如采用腦池內(nèi)接種)等。2.3在免疫抑制和感染方面的應(yīng)用及發(fā)展大鼠(rat,Rattusnorvegicus),別名褐鼠、棕鼠、溝鼠、大白鼠。大鼠的正常體溫為37.8～38.7℃。大鼠的近交品系有100多種,常用的主要有ACI系、F344系、M520系、SHR系、COP系和GH系等。常用的大鼠封閉群主要有Wistar白化大鼠、Sprague-Dawley白化大鼠、Long-Erans大鼠和Brown-Norway大鼠等。還有裸大鼠,其基因符號為rnu,純合裸大鼠(rnu/rnu)具有與裸小鼠基本相似的特征,無胸腺,缺乏功能性T淋巴細(xì)胞,B細(xì)胞功能基本正常,NK細(xì)胞活力增強,抵抗力差,易患呼吸道疾病,繁殖方法與裸小鼠相同,但軀干部仍有稀少被毛而并非像小鼠那樣完全無毛,頭部及四肢毛發(fā)更多。因其體型較大,有利于常規(guī)的血液學(xué)和血清生物化學(xué)分析。大鼠模型已在多種免疫和病理研究中得以使用,以闡明隱球菌病的某些特征。大鼠可以很好地用來構(gòu)建肺部隱球菌慢性感染和潛伏感染模型,這種感染動物模型可經(jīng)糖皮質(zhì)類固醇激素處理后激發(fā)。經(jīng)氣管接種隱球菌感染大鼠動物模型可以復(fù)制人類隱球菌肺炎的許多特征,如細(xì)胞趨化、肉芽腫反應(yīng)、微小的肺外播散以及血清中低滴度的莢膜多糖抗原。事實上,Goldman等對大鼠模型研究結(jié)果顯示在血清中檢測到隱球菌多糖抗原時新生隱球菌可能已經(jīng)向肺外播散。與大部分近交系小鼠相比,免疫抑制的大鼠經(jīng)氣管吸入法建立隱球菌肺部感染模型存在更大的不確定性,說明大鼠比小鼠對隱球菌更具內(nèi)在的抵抗力。研究顯示這種抵抗力的差異可能與肺泡巨噬細(xì)胞抗隱球菌的能力有關(guān)。大鼠已被進(jìn)一步改造為研究肺部隱球菌病致病機理的一個模型。新生隱球菌可能是大鼠的一種自然致病菌,可引起自然界大鼠的肺部感染。由于大鼠比小鼠體積大,因此氣管內(nèi)接種能較易成功而不需要特定的外科技術(shù)支持,且不會對組織或肺結(jié)構(gòu)產(chǎn)生可能的損害。在大鼠模型中,早期雖可產(chǎn)生肺外播散,但通常情況下感染局限在肺部。因而在不需要特異性免疫抑制的情況下即可成功構(gòu)建亞急性免疫反應(yīng)和感染的研究模型。大鼠體型較大的另一個優(yōu)勢是其也可以通過腦池注射的方法直接構(gòu)建隱球菌腦膜炎大鼠模型,但相對兔隱球菌腦膜炎模型而言,其操作更為精細(xì)且死亡率高。且其由于體型較兔小而使其在腦脊的采集方面的缺點顯而易見。與小鼠相比,大鼠的較大體型可以較易通過經(jīng)氣管內(nèi)吸入感染成功構(gòu)建模型而無需外科手術(shù)支持,更能為研究者提供進(jìn)行部位特異性和動力學(xué)研究的技術(shù)可能,如進(jìn)行支氣管灌洗術(shù)和腦脊液采樣等。大鼠可采用近交系動物也比較多,這為研究隱球菌感染后宿主的各種遺傳學(xué)、免疫學(xué)反應(yīng)提供可能。大鼠的基因組相對兔而言較為簡單,使其為研究隱球菌感染后遺傳學(xué)反應(yīng)提供了更為光明的前景。其缺點是飼養(yǎng)費用較小鼠昂貴,可用免疫學(xué)試劑較小鼠少,使其在研究隱球菌感染后宿主免疫反應(yīng)特征方面更為困難。2.4宿主的免疫反應(yīng)實驗小鼠(mouse,Musmuscculus),我國目前使用最廣泛的是昆明小鼠,常用的小鼠近交品系主要有:A系、AKR系、BALB/c系、CBA系、C3H系、C57BL/6系、DBA/1系、DBA/2系、NZB系、SJL/N系、AFB系、C3HA系。突變系中目前在真菌(隱球菌)研究最重要的是通過基因敲除的方法所產(chǎn)生的不同基因敲除小鼠。目前敲除的主要目的基因包括細(xì)胞因子、各種酶、細(xì)胞表面受體、淋巴細(xì)胞亞型等。基因敲除小鼠對研究宿主在隱球菌感染后的反應(yīng)具有非常重要的價值。如Toll-likereceptors(TLRs)基因敲除小鼠(TLR2-/-)明顯易產(chǎn)生肺部或系統(tǒng)性隱球菌感染;IFN-γ基因敲除小鼠易產(chǎn)生血清型A的隱球菌系統(tǒng)性感染。另外應(yīng)用于實驗研究的基因敲除小鼠有IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-23等。各種近交品系的小鼠對隱球菌感染的易感性存在不同,這些差異有助于用來研究探討致病機理。例如,CBA/J和BALB/c小鼠比C57BL/6小鼠對肺感染更具抵抗力。這些小鼠種系間的差異可用來尋找細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中更為細(xì)小的缺陷和控制隱球菌病的特異性效應(yīng)器功能。小鼠種系間易感性的差異甚至能將重要的免疫因子定位到宿主染色體的特異性區(qū)域。CB-17小鼠比BALB/c小鼠具有更強的從肺中清除新生隱球菌的能力。缺失CD4+T淋巴細(xì)胞的小鼠肺組織對新生隱球菌炎癥反應(yīng)弱,而CD8+T淋巴細(xì)胞缺失的小鼠肺清除新生隱球菌能力下降,喪失遲發(fā)型超敏反應(yīng)且不識別抗原或在體外試驗無淋巴細(xì)胞增殖。這些研究結(jié)果表明對隱球菌感染的主要抵抗力是復(fù)雜的和多基因控制的。這些研究顯示宿主(小鼠)對隱球菌保護(hù)性免疫反應(yīng)的廣度。這種免疫反應(yīng)是多因素的,包括細(xì)胞和體液免疫,兩者均受到基因控制。近交系小鼠是目前研究隱球菌感染最普遍應(yīng)用的實驗動物。不同隱球菌菌株在同一近交系中具有不同的致病力。而在綜合的毒性研究中,每組實驗中宿主反應(yīng)相對一致這是非常有利的,而近交系小鼠模型通常能做到這一點。同時通過遺傳或免疫方法可以改變小鼠的免疫能力,該特征在探討特異性宿主-寄生菌間相互作用方面相當(dāng)有幫助。近交系小鼠很容易通過氣管吸入法、鼻飼法、靜脈注射法和腹腔注射法等構(gòu)建隱球菌感染動物模型且不需要進(jìn)行免疫抑制預(yù)處理。目前發(fā)現(xiàn)了一系列小鼠自發(fā)性的免疫系統(tǒng)的遺傳缺陷使其對隱球菌感染極為敏感,這些基因主要有Hc基因(其突變使小鼠C5補體缺失)、IgH復(fù)合物(功能尚不明確)、Btk(Bruton酪氨酸激酶,影響B(tài)淋巴細(xì)胞的進(jìn)化和功能)、Lyst(溶酶體運輸調(diào)節(jié))、FoxN1(編碼交叉盒N1轉(zhuǎn)錄因子)、Prkdc(影響B(tài)和T淋巴細(xì)胞功能)以及H2(主要組織相溶性復(fù)合物)等[13,14,15,16,17,18]。這些突變小鼠是研究宿主對隱球菌免疫反應(yīng)的遺傳學(xué)特征的重要模型動物。例如,同樣接種新生隱球菌,C5缺陷小鼠(DBA/2)將很快死于急性隱球菌性肺炎,但當(dāng)接種量減少時將只產(chǎn)生遲發(fā)進(jìn)行性腦膜腦炎。在該宿主中可以看出接種量對感染表現(xiàn)的重要性。相反,應(yīng)用相同的接種量和菌株,BALB/c小鼠遠(yuǎn)比DBA/2小鼠生存時間長。這些結(jié)果突出表明了宿主因素對感染結(jié)果的影響。C5缺陷小鼠在組織病理學(xué)上顯示對新生隱球菌炎癥反應(yīng)明顯下降,可能與缺乏趨化因子C5a有關(guān)。與人類的致病有一定的類似的是易感小鼠可從肺部實驗感染后播散到全身感染。盡管如此,目前還可以采用靜脈注射和顱內(nèi)注射的方法構(gòu)建隱球菌播散性感染小鼠模型。曾有報道采用靜脈注射方法構(gòu)建隱球菌小鼠感染模型,證明小莢膜隱球菌可通過血液系統(tǒng)跨血腦屏障引起腦膜腦炎。而采用顱內(nèi)注射方法構(gòu)建小鼠隱球菌感染模型,證明了神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)吞噬細(xì)胞吞噬菌體是模型小鼠存在的重要因素。構(gòu)建小鼠隱球菌感染模型的接種方法多種多樣,其中腹腔注射接種方法最為方便,一般所需的病原菌量為105～107CFU。但是經(jīng)腹腔注射接種的方法是否可引起大腦等其他器官播散性感染存在的不確定性,即有些模型可能易引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染而有些則不能。靜脈注射接種法是最標(biāo)準(zhǔn)化和最容易定量的技術(shù),所需的菌量一般為103～105CFU就可引起播散性感染,如肺、肝、脾、腎以及腦膜炎等。但采用靜脈注射接種法所構(gòu)建的模型動物內(nèi)臟菌負(fù)荷可隨時間的延長而下降,最終僅留有腦部感染存在,這在一定程度上也顯示了隱球菌感染的過程。氣管吸入或鼻飼法接種可能是最接近自然感染的方法,一般通過吸入含103～104CFU的30～50μL菌液來構(gòu)建,需要麻醉模型動物后將該菌液滴入鼻腔使其吸入。該方法需要注意的是其麻醉的深度問題,深度應(yīng)達(dá)到抑制小鼠吞咽功能以防止菌液“吞入”消化道。如果麻醉太淺可能使吸入菌量太小而大部分被吞入消化道或者被噴出鼻腔,而麻醉太深可導(dǎo)致實驗動物無法吸入菌液。在實際操作中應(yīng)使實驗動物處于垂直位并將其嘴部閉緊以確保菌液能更好地被吸入肺部。顱內(nèi)接種可使我們直接研究隱球菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的增生情況,中樞神經(jīng)系統(tǒng)是隱球菌感染最重要的部位。顱內(nèi)接種可通過在腦后半部用細(xì)小針頭插入至腦皮質(zhì)約1～3mm