第2章基因工程藥物

第1章基因工程藥物重點：制備基因工程藥物的基本過程

不能忘記的人1953年4月25日，英國《自然》雜志發(fā)表了沃森和克立克的文章“核酸的分子結構—DNA的一個結構模型”。標志著DNA雙螺旋結構的建立，從此，遺傳學和生物學的歷史從細胞階段進入了分子階段。

不能忘記的人FSangerWGilbert

Sanger（英國化學家）最早測定胰島素的氨基酸順序獲得1958年諾貝爾化獎。22年后，他因測定了一種噬菌體的一級結構獲1980年的諾貝爾化學獎。

Gilbert在DNA測序領域，因其卓越的工作獲得1980年諾貝爾化學獎。

不能忘記的人

PaulBerg

Berg

（美國生物化學家）通過把兩個不同來源的DNA連結在一起并發(fā)揮其應有的生物學功能，證明了完全可以在體外對基因進行操作。他作為“重組DNA技術之父”于1980年獲諾貝爾化獎。

不能忘記的人KaryBMullis1985年穆利斯發(fā)明了高效復制DNA片段的聚和酶鏈式反應（PCR）技術，利用該技術可從極其微量的樣品中大量生產(chǎn)DNA分子，使基因工程獲得了革命性發(fā)展?；蚬こ碳夹g定義：狹義上又稱DNA重組技術，將一種生物細胞基因分離出來，在體外進行酶切和連接并插入質(zhì)粒、病毒等載體分子構成遺傳物質(zhì)的新組合，引入另一種宿主菌細胞后使目的基因得以復制和表達的技術?；蚬こ碳夹g操作技術1、選擇目的基因（生物體內(nèi)獲取、PCR）2、利用連接酶將外源DNA連接到載體上3、載體轉(zhuǎn)入宿主細胞4、宿主細胞的鑒定篩選5、大規(guī)模培養(yǎng)6、分離純化目的蛋白基因工程技術外源基因的篩選、合成技術基因工程的核心內(nèi)容是對不同來源的DNA進行重組。1、基因組文庫：物理或酶切法將染色體DNA降解，然后插入到載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)入宿主細胞內(nèi)，許多宿主細胞一起組成含有基因組各個DNA片段的集合體。優(yōu)點：信息全面。缺點：工作量大（尤其是基因組較大時）基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝鳥槍法（shotgun）10基因工程技術2、cDNA文庫：真核細胞具有內(nèi)含子和外顯子。以mRNA為模板經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的DNA序列，再復制成雙鏈DNA與載體連接轉(zhuǎn)入受體細胞，構建cDNA文庫。優(yōu)點：較基因組文庫小，篩選目標相對簡單。cDNA文庫的組建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA

逆轉(zhuǎn)錄法就是分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行cDNA克隆表達。123、PCR技術

PCR技術：1985年由美國Cetus首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。優(yōu)點：敏感度高、特異性強、產(chǎn)率高、重復性好以及快速簡便能夠，比較容易地對目的基因進行分析、鑒定。獲1993年諾貝爾化學獎。

PCR的原理：用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復制過程。以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5′末端和3′末端互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。

變性：加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。退火(復性):降溫后模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合，也存在兩條模板鏈之間的結合，但由于引物的高濃度，結構簡單的特點，主要的結合發(fā)生在模板與引物之間。55℃30″3.延伸：將反應溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合酶、4種dNTPs等存在的條件下，以引物的3′端開始，結合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈。

上述3步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～40個循環(huán)后DNA可擴增106～109倍。

PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C雙鏈DNA分子雙鏈斷開

循環(huán)1模板與引物結合循環(huán)1TaqTaq循環(huán)1TaqTaq循環(huán)1循環(huán)1雙鏈斷開循環(huán)2模板與引物結合循環(huán)2TaqTaqTaqTaq循環(huán)294℃變性雙鏈斷開循環(huán)3循環(huán)3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq循環(huán)3循環(huán)n基因工程技術4、DNA的人工化學合成目前常用的有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亞磷酸三酯法。合成片段較小、價格昂貴?；蚬こ碳夹g基因克隆酶學基礎1、限制性內(nèi)切酶外切酶：從核酸的一端把核苷酸水解下來的酶內(nèi)切酶：從核酸鏈中間通過水解3’-5’磷酸二酯鍵切斷核酸鏈的酶。其中某些內(nèi)切酶只能識別專一核酸序列并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，。主要功能是限制外源DNA的存在33/35EcoliK株噬菌體EcoliK株其他Ecoli菌株限制現(xiàn)象

微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。34/35限制性內(nèi)切酶

能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖。35/35

細菌能將外來的DNA片段在某些專一位點上切斷，保證其不為外來噬菌體所感染，而自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護。

此酶在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內(nèi)切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA。

此酶在序列5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’中的胞嘧啶C5上引入甲基.（1）dam甲基化酶（2）dcm甲基化酶甲基化酶

：在專一位點上甲基化，與限制性內(nèi)切酶相對應經(jīng)修飾的DNA不再被限制酶降解。36/35I類識別位點，并切開之，但識別位點并非嚴格專一，ATP依賴II類識別位點嚴格專一，并在識別位點內(nèi)將單鏈切斷III類識別位點嚴格專一，但切點不專一，往往不在識別位點內(nèi)部，ATP依賴基因工程中具有實用價值的是II類限制性內(nèi)切酶★★★分類基因工程技術基因工程中的應用：識別位點不專一的用處不大，識別和切割專一位點，可用于分離構建來自不同基因組的DNA片段，是DNA重組技術中最常用的工具酶38/35第1個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，大寫；第2，3二個字母是該細菌的種名，小寫；第4個字母代表株；用大寫羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬種株序Haemophilusinfluenzaed株從流感嗜血桿菌d株中分離到的第3個限制酶前三個字母用斜體表示。以限制酶來源的微生物學名進行命名屬名+種名+株/型+發(fā)現(xiàn)序號39/35

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’EcoRⅠ的識別序列粘性末端：DNA鏈被交錯切開形成凸起末端，這種凸起末端的核苷酸序列互補，可形成氫鍵結合，故稱為粘性末端40/35

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’另一種是垂直切割形成平末端41/351970年Smith等流感嗜血桿菌株中分離出HindII和HindIII已分離400余種II類酶商品化的約有一百種實驗室常用的二十種核糖核酸（RNA）酶：RNaseA：RNA專一的內(nèi)切酶，可特異的作用于嘧啶核苷酸，主要用于除去DNA制備物中的RNA。RNaseH：是一種核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，但該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA，也不會降解單鏈RNA。DNA連接酶：既可以連接兩個具有粘性末端的DNA片段，也可以連接兩個具有平末端的DNA片段DNA聚合酶：是細胞復制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA為復制模板，從將DNA由5'端點開始復制到3'端的酶。脫氧核糖核酸酶：是將單鏈或雙鏈DNA同等程度地隨機分解，生成具有5'-P末端寡核苷酸的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。在Mg2+存在時，能在雙鏈DNA上隨機地產(chǎn)生切口；而在Mn2+存在下能將雙鏈DNA同時切斷，使DNA片段化。45

基因載體：是一類能自我復制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細胞?；蚬こ梯d體46

（1）在宿主細胞內(nèi)能獨立復制。（2）有選擇性標記，指示重組DNA分子是否進入到宿主細胞內(nèi)。（3）有一段多克隆位點以供外源DNA插入，外源DNA插入

其中不影響載體的復制。二、基因工程對載體的要求（4）分子量小，拷貝數(shù)多。47多克隆位點ori復制起始點遺傳標記Amppolylinker基因載體48多種酶切口多克隆位點限制性內(nèi)切酶單一酶切口多克隆位點：供外源DNA插入的位點，這個位點稱為克隆位點，一般為限制性內(nèi)切酶位點。該酶切位點在整個載體上是唯一的。多克隆位點集中在一個很短的序列內(nèi)49抗Amp宿主細菌含Amp培養(yǎng)基50宿主細胞ori51

基因工程中常用的載體：三、載體的種類質(zhì)粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體動物病毒（virus）52

基因工程中常用的載體：三、載體的種類質(zhì)粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體動物病毒（virus）DNA重組外源基因與載體連接粘性末端連接：同一限制性內(nèi)切酶酶切，DNA連接酶催化。平末端連接：目的片段與載體沒有共同的粘性末端限制性內(nèi)切酶位點。不同酶酶切，用適當?shù)拿秆a平或是消去末端。平末端內(nèi)連接效率低加尾連接：末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，在3’端加上polyG（A），設計出互補的核苷酸多聚物粘性末端在另一條鏈上加polyC（T），重組DNA導入受體菌

1.轉(zhuǎn)化：細菌獲得外源質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程。自然狀態(tài)下外源DNA進入細胞的效率很低。一般采用熱激法（感受態(tài)細胞）和電穿孔法

2.感染（轉(zhuǎn)導）：以噬菌體為媒介，將外源DNA導入細菌的過程。

3.轉(zhuǎn)染

指感受態(tài)的受體細胞捕獲和表達以噬菌體為載體的重組DNA分子的過程。轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)染的區(qū)別

轉(zhuǎn)導：通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。

轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接導入受體細胞的過程。平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌10-100

L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜重組菌的篩選1、根據(jù)重組菌的標志直接篩選（抗性）2、核酸雜交法（核酸探針）3、PCR法4、DNA限制內(nèi)切酶法5、核苷酸序列測定法DNA重組基因工程菌表達水平的優(yōu)化高效基因工程菌：具有高的產(chǎn)物表達水平、穩(wěn)定的遺傳特性和較強的目標產(chǎn)物積累能力。1、啟動子的優(yōu)化；2、密碼子優(yōu)化；3、表達系統(tǒng)優(yōu)化（菌株選擇）等微生物培養(yǎng)技術作業(yè)基因工程操作技術的基本流程?；蚬こ坦ぞ呙傅姆N類及其特征外源基因與載體的連接方式有哪些微生物培養(yǎng)技術以重組DNA技術為標志的現(xiàn)代生物技術極大的促進了生物制藥技術的發(fā)展，微生物作為常用的宿主表達系統(tǒng)，廣泛的應用于特殊藥物的合成，構建基因工程菌是必要的上游步驟，外源基因編碼的目標產(chǎn)物大大量積累必須在后續(xù)的微生物培養(yǎng)階段實現(xiàn)，因此微生物的培養(yǎng)過程的優(yōu)化與否關系到外源基因的表達效率。高產(chǎn)菌株的選育與基因工程菌的構建菌種選育常用的方法是自然選育和誘變選育基因工程菌的構建屬于定向選育第一個獲得商業(yè)化的基因工程菌時轉(zhuǎn)入胰島素基因的大腸桿菌血紅蛋白也得到了應用分批培養(yǎng)中細菌的群體生長(131xing)

分批培養(yǎng)：采用完全封閉的容器，一次接種，一次性加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的方法，是實驗室培養(yǎng)微生物最常用的方法。單批培養(yǎng)、批式培養(yǎng)或密閉培養(yǎng)。

生長曲線：分批培養(yǎng)細菌時，以時間為橫坐標，以菌數(shù)對數(shù)為縱坐標的相關曲線。能反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。包括延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等四個生長時期。1、分批式操作特點：體積不變；沒有輸入，也沒有輸出，非衡態(tài)過程－發(fā)酵體系的組成（基質(zhì)、產(chǎn)物及細胞濃度）都隨發(fā)酵時間而變化。2023/10/1763將少量單細胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，測菌細胞數(shù)目。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌數(shù)目的對數(shù)為縱坐標，繪制所得的曲線。2023/10/1764生長曲線可分：延遲期對數(shù)期衰亡期穩(wěn)定期延遲期：延滯期、停滯期等特點合成代謝活躍，易產(chǎn)生誘導酶；細胞形態(tài)變大或增長，生長速率是零；細胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強；對外界不良條件敏感。影響延遲期長短的因素：菌種：繁殖速度快，延遲期較短；接種量：一般來說，適當增大接種量可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；培養(yǎng)基成分：①在天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合成培養(yǎng)基上的短；②接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時，會使延滯期加長。在發(fā)酵工業(yè)上需設法盡量縮短延遲期對數(shù)期：細胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加，其對數(shù)與時間呈直線關系。特點：代謝最旺盛，營養(yǎng)消耗最快；生長速率最大，即代時最短；菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致；細胞對理化因素較敏感。1、此時期的菌種比較健壯，是增殖噬菌體的最適菌齡；生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；2、是生理代謝及遺傳研究