農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的方法學(xué)要素

農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的方法學(xué)要素

對于生態(tài)系統(tǒng)中殘留的農(nóng)藥，大多數(shù)人并不關(guān)心系統(tǒng)中多個環(huán)節(jié)的影響，而是整個系統(tǒng)的影響。鑒于生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和復(fù)雜性,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的許多研究成果所蘊(yùn)藏的生態(tài)學(xué)意義,往往需要在經(jīng)過風(fēng)險評估之后方能得到揭示。正因為如此,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的研究內(nèi)容和研究方法與農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估體系之間始終存在著相互依存、相互制約及相互促進(jìn)的關(guān)系。近20年來,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)本身有了較快的發(fā)展,相應(yīng)地,農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估體系也在不斷發(fā)展和完善。對于后者,近年來已有不少相關(guān)文獻(xiàn)報道。在此,筆者擬主要從農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的概念和方法學(xué)要素方面進(jìn)行闡述,以加深人們對該學(xué)科的認(rèn)識和理解。1農(nóng)藥環(huán)境毒性化的概念“生態(tài)毒理學(xué)(ecotoxicology)”一詞最早是由法國毒理學(xué)家RenéTruhaut提出的。Truhaut當(dāng)時給生態(tài)毒理學(xué)所下的定義為:“毒理學(xué)的一個分支,注重研究自然或人類來源(人工合成)污染物對于作為生態(tài)系統(tǒng)組成部分的動物(包括人類)、植物和微生物等的整體影響”。自從Truhaut給出該定義之后,不斷有學(xué)者提出了自己的觀點。具體可參見Connell等、Chapman、王德銘、孟紫強(qiáng)及Tarazona等的著述?；诟髯缘膶I(yè)背景,這些學(xué)者就生態(tài)毒理學(xué)給出了不同的解釋,這在一定程度上影響了人們對“農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)”內(nèi)涵和外延的界定。比照Truhaut的定義,可以認(rèn)為,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)是研究農(nóng)藥及其有毒代謝產(chǎn)物對作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)組成部分的非靶標(biāo)生物影響的一門學(xué)科。農(nóng)藥在野外的遷移和降解,其過程與室內(nèi)模擬條件下相似,因此可采用室內(nèi)的研究結(jié)果外推,但就效應(yīng)而言,則必須重視二者的區(qū)別。一個明顯的例子,現(xiàn)實生態(tài)系統(tǒng)如果受到農(nóng)藥的脅迫,隨著脅迫因子的減弱或消失,系統(tǒng)本身有可能恢復(fù),但這在室內(nèi)條件下幾乎不可能發(fā)生。在現(xiàn)實生態(tài)系統(tǒng)中,農(nóng)藥直接的作用對象雖然是個體,但該個體身處包含多個物種的群落之中,而群落與外界之間又保持著頻繁的物質(zhì)和能量交換,因此若想揭示農(nóng)藥在系統(tǒng)層面的危害效應(yīng),必須借助生態(tài)學(xué)的理論和方法。作為起源關(guān)系極為密切的2個學(xué)科,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)和農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)在概念上存在交叉。其區(qū)別主要體現(xiàn)在:1)關(guān)注對象不同。對于非靶標(biāo)生物,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)重點關(guān)注人類,而農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)則重點關(guān)注人類以外的其他物種;在介質(zhì)方面,生態(tài)毒理學(xué)重點關(guān)注土壤、水/底泥系統(tǒng)以及大氣,而環(huán)境毒理學(xué)重點關(guān)注農(nóng)作物可食部分、飲用水以及人類頻繁活動的場所。2)關(guān)注層面不同。對于危害,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)重點關(guān)注農(nóng)藥的群落和系統(tǒng)效應(yīng),即關(guān)注農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和完整性是否因為農(nóng)藥的使用而遭到損害;而農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)目前重點關(guān)注農(nóng)藥在個體及個體以下層面的危害效應(yīng)。3)學(xué)科歸屬不同。農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)從本質(zhì)上講屬于預(yù)防醫(yī)學(xué)的一個分支,而農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)在本質(zhì)上屬于生態(tài)學(xué)。4)成果的應(yīng)用領(lǐng)域不同。農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的研究成果主要應(yīng)用于農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估;相應(yīng)地,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)的研究成果主要應(yīng)用于農(nóng)藥健康風(fēng)險評估。對于除人類以外的非靶標(biāo)生物的關(guān)注以及提倡用生態(tài)學(xué)方法進(jìn)行研究,是農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)區(qū)別于農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)的明顯特征。在現(xiàn)實科研中,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)家有時會以細(xì)胞、分子乃至基因為對象來研究農(nóng)藥的毒害效應(yīng),而農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)家有時也會采用“流行病學(xué)”等研究方法。但值得注意的是,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)家在從事流行病學(xué)調(diào)查時,他們所關(guān)注的始終是被調(diào)查群體中的個體———人,而農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)家在研究細(xì)胞、分子乃至基因時,他們其實并不關(guān)注農(nóng)藥在這些層面的毒害效應(yīng)本身,而是想進(jìn)一步了解這些毒害效應(yīng)與被暴露群體的生存狀況之間的關(guān)聯(lián)。2具體結(jié)果的確定農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究涉及面廣,內(nèi)容龐雜,因此只有突出重點、周密設(shè)計、嚴(yán)格實施,所得結(jié)果才有可能最大限度地滿足農(nóng)藥風(fēng)險評估的客觀需求。以下將從不同角度對農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的方法學(xué)要素加以探討。2.1測試周期按照歷期,農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評估試驗可分為“急性”、“亞急性(或稱“亞慢性”)”和“慢性”3種類型。2.1.1急性試驗的范疇急性試驗用于檢測生物短期接觸高劑量農(nóng)藥后的中毒反應(yīng)。典型的急性試驗是在一次性給藥的方式下進(jìn)行的,美國環(huán)保署(EPA)的“鳥類急性口服試驗”和“蜜蜂急性接觸試驗”即屬于此類型。而經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)的“蜜蜂急性經(jīng)口試驗”和我國現(xiàn)行“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則”中的“赤眼蜂(成蜂)急性接觸試驗”規(guī)定染毒時間為1h,均屬于不太典型的急性試驗。急性試驗要求受試生物在急性染毒后的觀察期要足夠長。所謂足夠長,是指在該時段內(nèi),農(nóng)藥對受試生物的毒害效應(yīng)隨觀察期的延續(xù)而明顯增強(qiáng),超出這一時段,農(nóng)藥的毒害效應(yīng)則不再隨觀察期的延續(xù)而增強(qiáng)。在OECD頒布的“魚類急性(96h)毒性試驗”、“水蚤急性(48h)毒性試驗”、“蚯蚓急性(14d)毒性試驗”、“鳥類(5d)飼喂毒性試驗”、“藻類(72h)生長抑制試驗”等試驗中,受試生物接觸藥劑的時間與試驗歷期相同,因此它們并非典型意義上的急性試驗。之所以仍將其劃歸于急性試驗的范疇,是因為在這些試驗中受試生物接觸藥劑的時間很短(通常只有1到數(shù)天),且該時間段只占受試生物整個生命歷期的很小一部分。除OECD“藻類(72h)生長抑制試驗”這樣的以種群抑制率為測試終點的試驗外,急性試驗通常以死亡率作為測試終點。2.1.2魚類毒性試驗亞急性試驗是在持續(xù)脅迫或重復(fù)給藥的方式下進(jìn)行的,此類試驗的歷期明顯長于急性試驗,如OECD的“魚類長期(14d)毒性試驗”,EPA的“蚯蚓亞慢性(28d)毒性試驗”等。雖然死亡率仍是常用的測試終點,但體長、體重等個體指標(biāo)在此類試驗中受到了更多的關(guān)注。2.1.3急性試驗與個體指標(biāo)慢性試驗是為衡量生物長期暴露于低劑量化學(xué)品中所受的毒害而設(shè)立的,其歷期通常涵蓋受試生物生活史的大部分時間或者整個世代,如EPA和OECD的“溞類(21d)繁殖毒性試驗”、OECD的“搖蚊沉積物毒性試驗”等。相對于急性試驗中的死亡率,慢性試驗更側(cè)重于關(guān)注受試生物的體長、體重等個體指標(biāo),以及生殖率、種群內(nèi)稟增長率等群體指標(biāo)。將急性試驗的結(jié)果與農(nóng)藥在環(huán)境中的短期沉積量相比較,可以得知農(nóng)藥對環(huán)境生物的急性風(fēng)險(acuterisk);相應(yīng)地,將亞急性或慢性的試驗結(jié)果與農(nóng)藥在環(huán)境中的長期沉積量相比較,可得知農(nóng)藥對環(huán)境生物的長期風(fēng)險(chronicrisk)。2.2采用客觀劑量法進(jìn)行試驗農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評估試驗的劑量(或濃度)設(shè)置方案主要有2種,即考慮或不考慮農(nóng)藥的環(huán)境沉積量,前者可稱之為“主觀劑量法”,后者可稱作“客觀劑量法”。所謂主觀劑量法,即試驗劑量(或濃度)是由研究者主觀確定的。采用該方法開展試驗時,其目的在于建立劑量-效應(yīng)方程,再根據(jù)所建立的方程求得x%效應(yīng)值(EDx)或x%效應(yīng)濃度(ECx),或者通過各處理組之間或處理組與對照組之間的差異顯著性分析,求得受試物的最高無作用劑量/最低有效劑量(NOED/LOED)或最高無作用濃度/最低效應(yīng)濃度(NOEC/LOEC),進(jìn)而確定受試物的最大允許劑量(maximalallowabletoxicantdosage,MATD)或最大允許濃度(maximalallowabletoxicantconcentration,MATC)。需要指出的是,采用主觀劑量法的試驗,因其以建立劑量-效應(yīng)方程、求取效應(yīng)中值(ED50)或效應(yīng)中濃度(EC50)為目的,所以判斷試驗設(shè)計合理與否,要看所設(shè)劑量下的效應(yīng)變化能否滿足回歸分析的需要。至于各劑量組(包括對照組)內(nèi)部是否需要設(shè)置重復(fù)以及需設(shè)置多少個重復(fù),在此并非重點(測試終點為數(shù)量型結(jié)果的例外,因為這些試驗中每一劑量組的數(shù)據(jù)均需要與對照組比對,因而此時的對照組宜多設(shè)重復(fù));相反,如果試驗以求取MATD或MATC為目的,則各劑量組(包括對照組)內(nèi)部不僅必須設(shè)置重復(fù),而且重復(fù)次數(shù)需達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn),以滿足差異顯著性分析的需要。采用客觀劑量法開展試驗時,研究者以農(nóng)藥的田間沉積量(或沉積濃度)作為劑量選擇的依據(jù)。天敵和土壤微生物是較多采用客觀劑量法進(jìn)行測試的生物類群。以田間沉積量(或沉積濃度)作為試驗劑量的選擇依據(jù),從理論上講,其結(jié)果可以直觀顯示受試農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險。然而該方法也具有局限性:首先,農(nóng)藥田間沉積量預(yù)測結(jié)果本身即存在一定的誤差;其次,即便選定的劑量能夠真實反映農(nóng)藥的田間沉積量,其所反映的也僅是某一位點和某一時刻的沉積量。一旦處理組的效應(yīng)與對照組差異不明顯,人們將無從推斷受試農(nóng)藥在更高劑量下可能產(chǎn)生的影響。可見從風(fēng)險評估的角度,客觀劑量法的試驗結(jié)果并不具有更高的利用價值,相反,將通過主觀測量法測得的有害劑量(ECx、NOEC/LOEC等)與暴露數(shù)據(jù)相對照,不但能夠判斷相關(guān)農(nóng)藥在某一時空節(jié)點的風(fēng)險大小,而且能夠給出這種風(fēng)險的時間和空間分布。2.3試驗的可控性按照試驗的可控性,農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評估試驗大致可分為“室內(nèi)”、“半田間”和“田間”3個層次。2.3.1人工土為主的受試物種室內(nèi)試驗要求在相對穩(wěn)定的環(huán)境條件下進(jìn)行。例如“OECD化學(xué)品測試準(zhǔn)則”判斷魚類和溞類試驗結(jié)果是否有效的前提之一,就是稀釋液中的溶解氧含量在試驗過程中能否保持在其飽和值的60%以上,為了滿足這一條件,有時需要周期性地更換稀釋液,甚至可能需要在“流水”條件下進(jìn)行試驗。再如土壤微生物試驗,“OECD化學(xué)品測試準(zhǔn)則”規(guī)定土壤含水量應(yīng)控制在最大持水量的40%~60%之間,相應(yīng)地,美國EPA“生態(tài)效應(yīng)測試準(zhǔn)則OPPTS850.5100”對于土壤含水量的規(guī)定值為10kPa左右。環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)化是人們對室內(nèi)試驗的一項基本要求。天然土壤由于理化性質(zhì)各異,導(dǎo)致農(nóng)藥在其中的有效性(availability)不同,因而有可能影響試驗結(jié)果的重現(xiàn)性,為此,除微生物試驗外,原本以土壤為基質(zhì)的試驗,目前大多以人工土代替。室內(nèi)生物試驗中所用的受試物種通常要求具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和/或生態(tài)價值,材料易得,并具有較強(qiáng)的生命力。我國現(xiàn)行“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則”推薦鯉魚Cyprinuscarpio和斑馬魚Brachydoniorerio作為魚類急性毒性試驗的代表物種。鯉魚在我國各地均有分布,又是重要的經(jīng)濟(jì)魚類,因此我國選用鯉魚的理由跟歐美國家選用虹鱒魚Oncorhynchusmykiss和太陽魚Lepomiscyanellus完全一致;斑馬魚是一種小型的熱帶觀賞魚,其在我國境內(nèi)并沒有自然分布,更談不上所謂經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值,但該魚室內(nèi)生命力強(qiáng),易于繁殖,因而同樣成為了常用的受試物種;以同樣原因入選的受試物種還有非洲爪蟾Xenopuslaevis、赤子愛勝蚓Eiseniafoetida等。相反,在我國分布廣且具有重要經(jīng)濟(jì)價值的“四大家魚”(青魚、草魚、鰱魚、鳙魚)卻很少被選作毒性試驗的受試物種,其原因則是由于這些魚類的幼體很難適應(yīng)室內(nèi)飼養(yǎng)。雖然室內(nèi)試驗的對象以單物種居多,但也有例外。在檢測化學(xué)品對土壤微生物碳轉(zhuǎn)化和氮轉(zhuǎn)化影響的試驗中,作為介質(zhì)的土壤中包含了多種微生物,因此此類試驗在本質(zhì)上屬于小型微宇宙試驗。類似的還有美國測試和材料學(xué)會(ASTM)頒布的“標(biāo)準(zhǔn)化水生微宇宙(standardaquaticmicrocosm,SAM)試驗”。室內(nèi)試驗所能采用的給藥方式不可避免地會受到風(fēng)險評估體系的影響。以家蠶為例,從技術(shù)的角度,可采用的給藥方式包括“浸葉”、“浸蟲”、“點滴”、“拌葉”、“定量噴霧”等,但從風(fēng)險評估的角度考慮,只有定量噴霧法和拌葉法的測定結(jié)果能夠與現(xiàn)有評估體系較好地銜接,因此應(yīng)優(yōu)先采用。當(dāng)可選的給藥方式不止1種時,應(yīng)以評估目標(biāo)作為選擇的向?qū)?。如對于非靶?biāo)植物,可用的給藥方式有“水培”、“土培”、“葉面噴霧”等,但對于莖葉處理劑,如除草劑草甘膦等,則只有葉面噴霧法的測定結(jié)果能夠為風(fēng)險評估提供有價值的信息,采用其他給藥方式所得的測量結(jié)果很可能使評估結(jié)論出現(xiàn)偏差。2.3.2田間試驗在農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估中的作用以室內(nèi)試驗,特別是單物種室內(nèi)試驗的結(jié)果來推測農(nóng)藥對農(nóng)田及周邊區(qū)域的生態(tài)效應(yīng),其結(jié)果的可靠性往往受到質(zhì)疑。這主要是因為:1)野外環(huán)境條件,如溫度、濕度、光照等的晝夜和季節(jié)性變化,以及農(nóng)藥野外殘留的時空變化等在室內(nèi)條件下很難準(zhǔn)確模擬。2)農(nóng)藥的諸多效應(yīng),如間接毒性、二次毒性、趨避作用等,在室內(nèi)條件下很難被準(zhǔn)確測量。3)在室內(nèi)條件下,人們很難觀測到被暴露系統(tǒng)的恢復(fù)情況。鑒于室內(nèi)試驗在預(yù)測農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)方面的局限性,當(dāng)存在爭議時,田間試驗就成為了人們否認(rèn)(或者確認(rèn))農(nóng)藥產(chǎn)品生態(tài)風(fēng)險的最終依據(jù)。圖1形象地展示了田間試驗在農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估中的地位和作用。從圖1可看出,田間試驗的作用主要體現(xiàn)在:1)為(暴露)模型提供來自田間的驗證數(shù)據(jù)。2)最終否認(rèn)(或確認(rèn))農(nóng)藥產(chǎn)品的生態(tài)風(fēng)險。3)為農(nóng)藥的“登記后評估”提供數(shù)據(jù)。田間試驗雖然能夠較為真實地反映農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險,但通常存在花費昂貴、試驗周期長、可控程度低、結(jié)果重現(xiàn)性差等缺點。鑒于此,人們又設(shè)計出一系列相當(dāng)于中間環(huán)節(jié)的試驗系統(tǒng),即“半田間試驗”系統(tǒng)。根據(jù)所占空間的大小,半田間試驗系統(tǒng)可進(jìn)一步被劃分為“微宇宙(microcosms)”、“中宇宙(mesocosms)”及“大宇宙(macrocosms)”,其共同特點是既可在一定程度上保留生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能,又允許人們對系統(tǒng)進(jìn)行一定程度的操控。至于微宇宙、中宇宙和大宇宙的具體規(guī)格劃分,目前學(xué)界尚無定論。對水生生物而言,Heimbach認(rèn)為:小于0.1m3的,只能算作“燒杯”;0.1~1m3的,可算作“水族箱”;1~15m3的,可視為微宇宙;而可以被稱作中宇宙的,應(yīng)該是體積大于15m3的水生生態(tài)系統(tǒng)。從生物結(jié)構(gòu)上,上述半田間試驗系統(tǒng)又可劃分為“靜水(lentic)”和“流水(lotic)”兩大類。其中靜水系統(tǒng)可以再區(qū)分為以維管植物為主要能量來源、物種構(gòu)成比較復(fù)雜的“淺水系統(tǒng)”和以浮游植物為主要能量來源、物種構(gòu)成比較簡單的“深水系統(tǒng)”。需要特別指出的是,淺水系統(tǒng)所代表的池塘沿岸和排水溝渠是較容易受到農(nóng)藥污染的區(qū)域,故應(yīng)得到農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)家的重點關(guān)注。2.3.3對受試生物的選擇從經(jīng)濟(jì)和時效性的角度,為評估農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)而開展的試驗應(yīng)遵從先急性后慢性,先室內(nèi)后田間的順序。如果室內(nèi)試驗的結(jié)果能夠明確否認(rèn)受試農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險,整個試驗即可終止;相反,如果室內(nèi)試驗的結(jié)果顯示受試農(nóng)藥具有風(fēng)險,要明確這種風(fēng)險是否真會在田間發(fā)生,則需進(jìn)一步開展半田間甚至田間試驗。為避免在試驗的任何層次上出現(xiàn)假陰性結(jié)果,試驗設(shè)計者應(yīng)該確保受試生物在室內(nèi)試驗中所受的脅迫強(qiáng)度高于半田間或田間試驗。例如“OECD化學(xué)品測試準(zhǔn)則”中的“魚類急性(96h)毒性試驗”,其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一就是在整個試驗過程中,受試藥劑在稀釋液中的實際濃度始終不低于理論添加濃度的20%。又如“OECD化學(xué)品測試準(zhǔn)則”之“土壤微生物氮轉(zhuǎn)化試驗”和“土壤微生物碳轉(zhuǎn)化試驗”給土壤微生物群落設(shè)定了一個代表“最差狀況(worstcasesituation)”的基質(zhì)條件,預(yù)期化學(xué)品在此基質(zhì)中的有效性最高且降解率最低,如果在以該基質(zhì)配制的毒土中測得農(nóng)藥對土壤微生物碳轉(zhuǎn)化或氮轉(zhuǎn)化的抑制作用不明顯,就無需再用其他基質(zhì)進(jìn)行測試。同樣是出于避免假陰性結(jié)果的考慮,在受試生物的選擇上,生態(tài)毒理學(xué)家在室內(nèi)試驗中傾向采用處于生理敏感期的生物個體,如出生后6~24h的幼溞、蛙類蝌蚪、2齡起家蠶(其大小可確保癥狀觀察能夠順利進(jìn)行)、羽化赤眼蜂等。這與在室內(nèi)藥效試驗中傾向采用非敏感個體(如末齡幼蟲)的經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)家的做法有所不同。2.4模型預(yù)測法開展暴露評估的目的在于確定農(nóng)藥在環(huán)境介質(zhì)中的沉積量及沉積范圍。方法主要有2種:實地測量和模型預(yù)測。表1為農(nóng)藥初始?xì)埩舴植嫉膶嵉販y量數(shù)據(jù)(測量時的氣溫為25℃,風(fēng)速5m/s)?；谶@些數(shù)據(jù),人們可以推算出藥劑在不同作物農(nóng)田周圍的沉積量和沉積范圍。模型預(yù)測是確定農(nóng)藥沉積量和沉積范圍的另一種常用方法。人們針對特定場景(scenario)開發(fā)了相應(yīng)的預(yù)測模型,如預(yù)測農(nóng)藥在水體中沉積量的GENEEC和EXAMS,預(yù)測農(nóng)藥在旱地沉積量的T-REX和TIM,以及可預(yù)測農(nóng)藥在大氣中含量的AgDRIFTue5f8和AgDISP等。在運(yùn)用上述模型時,人們首先需要了解相關(guān)農(nóng)藥的使用方式和使用量,此外還需了解該農(nóng)藥的理化性質(zhì)和環(huán)境行為等信息(表2)。其中涉及農(nóng)藥環(huán)境行為的信息既可來自室內(nèi)試驗,也可來自半田間或田間試驗,但在大多數(shù)情況下其來自于室內(nèi)試驗。2.5衡量尺度的統(tǒng)一將農(nóng)藥暴露水平與其有害劑量相比對,即可獲得該農(nóng)藥對于非靶標(biāo)生物的“風(fēng)險商值(riskquotient,RQ)”。RQ屬于無單位量綱。作為RQ的決定因子,暴露水平和有害劑量在衡量尺度上應(yīng)該一致,而基于化學(xué)分析的“實測濃度(actualconcentrations)”正是提供了這樣一種衡量尺度。因此從理論上講,有害劑量通常應(yīng)該以實測濃度來衡量;至于“名義濃度(nominalconcentrations)”,只有當(dāng)有證據(jù)表明其與實測濃度高度吻合(吻合度達(dá)到80%)時,才可取代后者而參與有害劑量的確定,進(jìn)而參與RQ的求取。由此可見,從風(fēng)險評估的角度,在進(jìn)行毒性試驗的過程中總是應(yīng)該同步測量各處理組的農(nóng)藥含量,以求得基于實測濃度的ECx或MATC。2.6追溯性研究retrospityfora在農(nóng)藥產(chǎn)品登記之前開展的研究,可以稱之為“預(yù)測性研究(prospectivestudies)”,旨在明確農(nóng)藥產(chǎn)品入市之后可能造成的生態(tài)風(fēng)險;針對已經(jīng)獲得登記的農(nóng)藥產(chǎn)品而開展的研究,應(yīng)該稱之為“追溯性研究(retrospectivestudies)”。盡管生態(tài)毒理學(xué)的研究方法和生態(tài)風(fēng)險評估體系均在不斷改進(jìn)和完善,但鑒于生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和復(fù)雜性,任何管理部門和研究機(jī)構(gòu)都不能確保已通過評估程序并獲得登記的農(nóng)藥產(chǎn)品在實際使用中不會對農(nóng)田及周邊區(qū)域造成不良影響,因此有必要開展追溯性研究。不僅如此,有一些農(nóng)藥產(chǎn)品在預(yù)測性研究中即被認(rèn)為具有某種程度的生態(tài)風(fēng)險,但經(jīng)過風(fēng)險-效益評估,在附加了限制條件之后被允許進(jìn)入市場,至于這些限制是否合理,是否需要進(jìn)行修改,要回答諸如此類的問題,也需要開展追溯性研究。追溯性研究的結(jié)果仍有可能對評估結(jié)論產(chǎn)生重大影響。2.7he和alad在包括農(nóng)藥在內(nèi)的化學(xué)污染物的脅迫下,生命有機(jī)體的生理和生化過程會發(fā)生改變,這些改變可通過組織學(xué)和形態(tài)學(xué)等特征表現(xiàn)出來,甚至影響到物種的行為和生存。因此從理論上講,任何與生命活動有關(guān)的生理和生化過程,包括相關(guān)的組織學(xué)、形態(tài)學(xué)特征,只要易受污染物的影響而發(fā)生變化,均有可能成為生態(tài)毒理學(xué)研究的“生物標(biāo)志物(biomarkers)”。在眾多生物標(biāo)志物中,應(yīng)用最廣的當(dāng)數(shù)來自動物腦和血清中的膽堿酯酶(cholinesterase,ChE)。從應(yīng)用的角度,生態(tài)毒理學(xué)研究所選用的標(biāo)志物應(yīng)該具有較高的靈敏度和適當(dāng)?shù)奶禺愋浴Ｒ园被阴１崦撍?aminolevulinatedehydratase,ALAD)為例,由于該酶對鉛十分敏感,若水禽血液中ALAD活性下降,則無需進(jìn)一步測定即可斷定水禽血液中鉛的含量達(dá)到了一定水平。同樣,當(dāng)水生和陸生動物腦和血清中ChE活性下降時,說明動物機(jī)體受到了有機(jī)磷或氨基甲酸酯類殺蟲劑的污染。就特異性而言,ChE不如ALAD,因為要想判斷污染源究竟來自何種有機(jī)磷或氨基甲酸酯,仍需要對樣品進(jìn)行化學(xué)分析。需要指出的是,生物標(biāo)志物的特異性并非越高越好,比如ALAD,其特異性雖高,但是對ALAD的測定結(jié)果并不能提供有關(guān)其他污染物的任何信息。除了顯示環(huán)境中污染物的存在之外,生態(tài)毒理學(xué)家還希望標(biāo)志物能夠顯示污染物的毒害效應(yīng),即具有預(yù)警功能。在儀器分析手段已日益完善的今天,生物標(biāo)志物之所以仍然能夠吸引研究者的關(guān)注,其原因正在于此。例如在溞類的研究中,人們已經(jīng)將注意力放在ChE活性變化與被暴露群體生物量變化的對應(yīng)關(guān)系上。需要指出的是,生物標(biāo)志物的反應(yīng)與污染物有害效應(yīng)之間是否存在對應(yīng)關(guān)系,以及究竟存在何種對應(yīng)關(guān)系,要視標(biāo)志物和污染物的種類和性質(zhì)而定。這方面尚有許多問題等待人們?nèi)ヌ骄俊ｉ_展農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評估試驗,往往需要大量收集物種及其生物量方面的信息。此類信息有時可以通過對諸如磷脂脂肪酸、幾丁質(zhì)酶等標(biāo)志物的測定而獲得。充分利用這類標(biāo)志物,可以在一定程度上減少因為取樣及樣品鑒定所造成的誤差。3glp體系的形成除上文已提到的主要方法學(xué)要素之外,另有一些要素,如良好實驗室規(guī)范(GLP)、試驗準(zhǔn)則、動物福利等,從概念上講它們并不專屬于農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué),但是這些要素深刻影響著該學(xué)科的研究內(nèi)容和研究方法,故在此一并加以探討。GLP的最初建立被認(rèn)為與20世紀(jì)70年代發(fā)生在美國的涉及藥品和化學(xué)品(主要是農(nóng)藥)的一系列動物試驗詐騙案件有關(guān)。1979年,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)頒布了世界上第一個GLP法規(guī);1980年,美國EPA頒布了有關(guān)農(nóng)藥的GLP法規(guī);1981年,以美國FDA的GLP法規(guī)為藍(lán)本,OECD推出了涵蓋所有化合物的GLP法規(guī)。我國GLP建設(shè)首先是從醫(yī)藥領(lǐng)域開始的,農(nóng)藥行業(yè)的GLP建設(shè)始于2002年,此后農(nóng)業(yè)部陸續(xù)制訂了涉及農(nóng)藥理化性質(zhì)、殘留、毒理和環(huán)境毒理的GLP準(zhǔn)則,并于2010年5月公告了沈陽化工研究院安全評價中心等6家農(nóng)藥GLP實驗室。建立GLP的目的在于加強(qiáng)對試驗機(jī)構(gòu)及試驗操作的管理。按照GLP的要求開展試驗,其相關(guān)的一切過程,包括人員任命、培訓(xùn)、樣品接收、試驗方案制定、試驗操作、樣品采集、儀器使用、試驗結(jié)果記錄、質(zhì)量核查、資料保存等均需要加以“文件化”,以便自查和外部核查。基于上述原因,GLP體系下形成的數(shù)據(jù)在真實性方面具有比較可靠的保障。對于農(nóng)藥,在涉及質(zhì)量、藥效、健康風(fēng)險及環(huán)境風(fēng)險的各項試驗中,產(chǎn)品質(zhì)量和藥效試驗較多關(guān)乎生產(chǎn)商的經(jīng)濟(jì)利益,而健康風(fēng)險和環(huán)境風(fēng)險試驗較多關(guān)乎公眾利益,為確保試驗結(jié)果的真實性,有必要將這2類試驗過程置于GLP的管控之下。對于一些探索性的課題,例如確認(rèn)化學(xué)品的某種未知危害方式或作用機(jī)理等時,出于知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)或其他類似原因,研究者不愿公布其研究過程或研究方法的細(xì)節(jié),這在學(xué)術(shù)界并非不可接受,但這種做法與GLP所倡導(dǎo)的“公開性”原則相沖突,所以在對于非GLP數(shù)據(jù)的選用上,風(fēng)險評估人員往往持謹(jǐn)慎態(tài)度,在同等條件下,他們會優(yōu)先選用GLP體系下的數(shù)據(jù)。3.2環(huán)境試驗的主要內(nèi)容人們早已認(rèn)識到,方法上的細(xì)微差別會對測試結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。例如在測定農(nóng)藥對魚的急性毒性時,供試魚的齡期、試驗溫度、暴露時間(48h或96h)、稀釋水的水質(zhì)等均會影響試驗結(jié)果。又如薄層層析試驗中,因土層厚度不同,農(nóng)藥在其上的移動性也會有所不同。為此有必要對測試方法加以規(guī)范,以保證不同實驗室的不同人員在不同時刻開展試驗,均能夠得出相同或相近的結(jié)果?？梢?制訂各類試驗準(zhǔn)則的目的之一是確保試驗結(jié)果的重現(xiàn)性。目前OECD所制定的化學(xué)品測試準(zhǔn)則中均包含了對試驗本身的質(zhì)量要求。例如“溞類(21d)繁殖毒性試驗”,其質(zhì)量要求之一是在試驗結(jié)束時對照組每一雌性個體的平均繁殖量≥60;又如“藻類(72h)生長抑制試驗”,其質(zhì)量要求之一是在試驗結(jié)束時對照組的細(xì)胞密度≥試驗開始時的16倍。這些要求若得到滿足,相關(guān)試驗才被認(rèn)為是合格的。從1981年起,OECD陸續(xù)頒布了一系列“化學(xué)品測試準(zhǔn)則”。這些準(zhǔn)則共包含5個系列:1)理化特性(physicalchemicalproperties);2)生物效應(yīng)(effectsonbioticsystems);3)降解和蓄積(degradationandaccumulation);4)健康效應(yīng)(healtheffects);5)其他(主要涉及農(nóng)藥殘留)。截至2013年7月,生物效應(yīng)系列中共收錄了涉及19種(類)生物的35項(急、慢性)試驗準(zhǔn)則;降解和蓄積系列中共收錄了涉及生物富積、土壤和水/沉積物(好氧和厭氧)轉(zhuǎn)化、(土)柱淋溶以及(水中)光轉(zhuǎn)化的7項試驗準(zhǔn)則;而有關(guān)水解和土壤吸附的試驗準(zhǔn)則被收錄在系列1(理化特性)中。這些準(zhǔn)則基本涵蓋了涉及農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估的各項室內(nèi)試驗。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)于1979年召開了有關(guān)農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估程序和資料要求的專家咨詢會議,并于1981年頒布了有關(guān)“農(nóng)藥登記環(huán)境試驗”的若干準(zhǔn)則(即:secondexpertconsultationonenvironmentalcriteriaforregistrationofpesticides)。1989年,FAO又對該準(zhǔn)則做了修訂,最終將農(nóng)藥登記的環(huán)境試驗分為3部分:1)理化性質(zhì)(physico-chemicalproperties);2)歸趨和移動(fateandmobilityinenvironment);3)環(huán)境效應(yīng)(effectsonenvironment)。美國EPA的“化學(xué)安全和污染防治辦公室(OCSPP)”自1996年起陸續(xù)制訂了11個系列的試驗準(zhǔn)則,即“OPPTS(theofficeofprevention,pesticidesandtoxicsubstances)測試準(zhǔn)則”。其中與農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估相關(guān)的試驗準(zhǔn)則分別被收錄在“OPPTS835”、“OPPTS840”和“OPPTS850”之中。OPPTS835收錄了涉及“歸趨(fate)”、“遷移(transport)”和“轉(zhuǎn)化(transformation)”方面的試驗準(zhǔn)則;OPPTS840收錄了涉及“噴霧漂移(spraydrift)”的試驗準(zhǔn)則;有關(guān)“生態(tài)效應(yīng)(ecologicaleffects)”的試驗準(zhǔn)則被收錄在了OPPTS850之中。我國有關(guān)農(nóng)藥環(huán)境行為和生態(tài)毒性試驗的“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則”最初由南京環(huán)境科學(xué)研究所負(fù)責(zé)起草,經(jīng)全國農(nóng)藥登記評審委員會討論通過后,由國家環(huán)境保護(hù)總局于1989年頒布。該準(zhǔn)則由“農(nóng)藥對環(huán)境安全性影響因素”、“農(nóng)藥環(huán)境安全性評價指標(biāo)與評價試驗程序”和“農(nóng)藥對環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則”3部分組成,重點是第3部分。在該部分中,農(nóng)藥對環(huán)境的安全性評價試驗被分為2類:“農(nóng)藥環(huán)境行為特征評價試驗”和“農(nóng)藥對非靶生物毒性試驗”,每一類分別包含10項試驗。以蔡道基院士為首的課題組于20世紀(jì)80年代中后期開展的一系列研究[58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73]為該準(zhǔn)則的起草奠定了基礎(chǔ)。自2004年我國第一批農(nóng)藥登記環(huán)境毒理試驗單位獲得認(rèn)證后,農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所多次組織有關(guān)專家對該準(zhǔn)則進(jìn)行補(bǔ)充和修訂,修訂后的“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則”共包含農(nóng)藥環(huán)境行為特征評價試驗8項,農(nóng)藥對非靶生物毒性試驗13項。隨著人們認(rèn)識的深化和提高,涉及農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的新的試驗準(zhǔn)則還將不斷建立,舊的準(zhǔn)則也會在修訂中不斷完善。但是,試驗準(zhǔn)則的建立當(dāng)前是、將來也主要是為了解決生態(tài)毒理學(xué)研究中一些具有共性的科學(xué)問題,在對農(nóng)藥等化學(xué)品開展生態(tài)毒理學(xué)研究的過程中,人們會不斷遇到各種特殊的具體問題,為解答這些特殊問題而開展的研究,現(xiàn)在沒有、將來也不一定有相關(guān)的試驗準(zhǔn)則可供依賴。3.3oecd對減少原則的繼受所謂“動物福利”,即要求人們從生理和心理上善待動物。早在1959年,Russell和Burch在其著作《TheP