低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)-第二講

低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)

第二講低溫生物醫(yī)學(xué)基本原理之一

-----溶液的凍結(jié)特性與細(xì)胞損傷迄今為止，人們采用的低溫保存方法，都是將細(xì)胞、組織置于含有抗凍劑的水溶液中進(jìn)行降溫、復(fù)溫的，而在細(xì)胞內(nèi)部也是富含多組分的水溶液。

因此，研究多元溶液的凍結(jié)、融化特性，以及他們可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷是低溫生物醫(yī)學(xué)的重要任務(wù)之一。2.1水-冰相圖三相點(diǎn),溫度為273.16K,壓力為610.62Pa(冰點(diǎn)?)1atm,凍結(jié)點(diǎn)是273.15K(冰點(diǎn)?)，這一段是冰水平衡線(給我們什么啟示?降低冰點(diǎn)？)是冰和水蒸氣平衡線(給我們什么啟示?)2.2純水的凍結(jié)特性tT０℃abcde樣品溫度降溫槽溫度降溫曲線a-b段：水以釋放顯熱的方式降溫；b-c段：當(dāng)過(guò)冷到b點(diǎn)時(shí)，冰晶形成，釋放的潛熱使樣品的溫度迅速回升到0℃；c-d段：水在平衡條件下，繼續(xù)析出冰晶，不斷釋放大量固化潛熱。d-e段：全部水被凍結(jié)后，固化的樣品以較快速率降溫。特別指出：d-e段的降溫速率可能遠(yuǎn)大于槽溫的下降速度，因此在生物細(xì)胞的低溫保存中，如何控制溶液固化后的冷卻速率是熱控制的一個(gè)重要問(wèn)題和難點(diǎn)。討論：怎么來(lái)控制？2.3過(guò)冷(supercooling)vs成核(nucleation)冰晶的成核過(guò)程主要由熱力學(xué)條件決定，而冰晶生長(zhǎng)過(guò)程主要由動(dòng)力學(xué)條件決定。等溫等壓條件下固液兩相體系的平衡條件是：液相吉布斯函數(shù)固相吉布斯函數(shù)冰點(diǎn)欲產(chǎn)生結(jié)晶的自發(fā)過(guò)程（即b到c），必須使液體過(guò)冷到某一低于Tf的溫度Tc。則有:過(guò)冷度形成冰晶的相變驅(qū)動(dòng)力過(guò)冷度越大，驅(qū)動(dòng)力也越大！怎么實(shí)現(xiàn)較大過(guò)冷度？成核理論當(dāng)水處于過(guò)冷態(tài)(亞穩(wěn)態(tài))時(shí),可能以兩種形式成核,即均勻成核(homogenousnucleation)和非均勻成核(heterogenousnucleation).均勻成核,是指在一個(gè)體系內(nèi)各處的成核幾率相等,由于熱起伏(或熱漲落)可能使原子或分子一時(shí)聚集成為新相的集團(tuán)(又稱胚芽,embryos),若胚芽大于臨界尺寸r*,則成為晶核。若液相分子熱起伏聚集的冰相集團(tuán)尺寸大于r*，則結(jié)冰過(guò)程為自發(fā)過(guò)程。胚芽區(qū)晶核區(qū)r*O固相的形成能固相尺寸r過(guò)冷度（℃）-30-20-10004080120晶核的臨界尺寸r*（A）當(dāng)水的過(guò)冷度增加時(shí)，偏離平衡態(tài)的程度增加，冰晶核的臨界尺寸和形成能就劇烈降低，這樣就極大地提高了形成冰晶核的幾率。怎樣才能形成較大過(guò)冷度？非均勻成核，又稱異相成核，是指水在塵埃、容器表面及其它異相表面等處形成晶核。一般所要求的過(guò)冷度比均勻成核要小得多。在實(shí)際樣品凍結(jié)過(guò)程中，過(guò)冷點(diǎn)（通常與凍結(jié)點(diǎn)混淆）具有一定的隨機(jī)性！那我們要怎么解決這個(gè)問(wèn)題？2.4冰晶形成生長(zhǎng)過(guò)程及其對(duì)細(xì)胞的影響（一）降溫速率的影響慢速降溫

形成晶核少，冰晶生長(zhǎng)速率快，最終形成數(shù)目較少但體積較大的冰晶?？焖俳禍?/p>

形成晶核多，冰晶生長(zhǎng)受限制，最終形成數(shù)目多而體積小的冰晶。（二）“置核（seeding）”的必要性在實(shí)際降溫過(guò)程中，水或溶液中可能出現(xiàn)較大過(guò)冷度；潛熱釋放完全后，可能出現(xiàn)很高的降溫速率。這兩種情況對(duì)細(xì)胞來(lái)講都是不利的。因此，將事先浸入液氮中的細(xì)絲取出，并輕輕接觸溶液表面，在極小的局部區(qū)域形成較大的過(guò)冷度，形成晶核。這有點(diǎn)像人工降雨中使用的降雨彈功能?。。ㄈo(wú)論何種結(jié)晶，冰晶的存在都會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致命的損傷??！coolingheating-135℃T(-90℃,-100℃,-110℃,-120℃,-130℃,-135℃)-82℃25℃10min-5℃/min60℃/minTheeffectsoffinaltemperatureoffirstcoolingoninducingformationofnuclei（YiXuetal.Unpublished,2013）Below-110C,therearesmalldifferencebetweenVs55andVs55+Fe;Buttheyareverydifferentatbetween-110Cto-82C,whichmeansVs55ismoreeasytoformnucleiabove-110Cbeforedevitrification.Why?n=3-135℃T(-90℃)-82℃25℃10min-5℃/min10℃/minCrystalsmaynotbewatchedintimewhenusing60C/min.Tomakesureenoughtimetofindthenucleusandclearlywatchthesubsequentcrystalsgrowingwhenpassingthroughthedevitrificationregion,10C/minwasusedhere.-80C-70C-65CVS55VS55+Fe復(fù)溫過(guò)程冰晶的再生長(zhǎng)的確存在2.5二元溶液的凍融特性溶液的概念兩種或多種物質(zhì)均勻混合且彼此呈分子狀態(tài)分布。包括氣、液、固三態(tài)。二元溶液凍結(jié)曲線FABE273DTATBTE0CωAωBωE溶液溶液+溶質(zhì)凍結(jié)溶液冰+溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω溫度T(K)如果初始濃度較大，且降溫速率很高，溶液來(lái)不及析出冰，就會(huì)使全部溶液非晶態(tài)固化。若濃度過(guò)高呢？（一）稀溶液的依數(shù)性質(zhì)拉烏爾定律（Raoult’slaw）

溶液中水的蒸汽壓降低值等于純水的蒸汽壓乘以溶質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)，即在相同外壓下，稀溶液的沸點(diǎn)要高于純水的沸點(diǎn)，其升高值正比于溶液的質(zhì)量摩爾濃度***實(shí)際水溶液冰點(diǎn)降低的依數(shù)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于理想的稀溶液，其冰點(diǎn)的降低正比于溶液的質(zhì)量摩爾濃度?！鱐f=Tf0-TfTf0——純水的冰點(diǎn)Tf——溶液的凍結(jié)點(diǎn)這個(gè)結(jié)論可以解釋什么？（二）被凍結(jié)組織融化過(guò)程的特點(diǎn)融化過(guò)程的作用是將已凍結(jié)的細(xì)胞、組織復(fù)溫，力求使之恢復(fù)到原先未凍結(jié)前的狀態(tài)。雖然它是凍結(jié)過(guò)程的反過(guò)程，但融化過(guò)程的熱控制要比凍結(jié)過(guò)程更為困難？？冰的比熱是水的一半，導(dǎo)熱系數(shù)卻是水的4倍，熱擴(kuò)散系數(shù)為8.6倍。比熱[J/(kg.K)]導(dǎo)熱系數(shù)[W/(m.K)]熱擴(kuò)散系數(shù)（m2/s）冰21202.2411.5×10-7水4217.30.5611.3×10-7凍結(jié)過(guò)程：樣品外層首先被凍結(jié)，繼續(xù)通過(guò)這個(gè)凍結(jié)層進(jìn)行吸熱。融化過(guò)程：樣品外層首先被融化，供熱過(guò)程必須通過(guò)這個(gè)液體層。（可以將降溫槽設(shè)定得很低，以提高降溫速率，融化過(guò)程可以采用類似的處理方法嗎？如何解決？）細(xì)胞體積隨滲透壓的變化（凍結(jié)過(guò)程）（三）