PCR實驗室的基本設備與要求

PCR實驗室的基本設備與規(guī)定臨床基因擴增檢查實驗室管理暫行方法第一章總則第一條為規(guī)范臨床基因擴增檢查實驗室管理，確保臨床基因擴增檢查質(zhì)量，使臨床診療和治療更為科學、合理，特制訂本方法。第二條臨床基因擴增檢查技術(shù)指以臨床診療治療為目的，以擴增檢測DNA或RNA為辦法的檢測技術(shù)，如聚合酶鏈反映（PCR）、連接酶鏈反映（LCR）、轉(zhuǎn)錄依賴的放大系統(tǒng)（TAS）自主序列復制系統(tǒng)（3SR）和鏈替代擴增（SDA）等。第三條本方法合用于開展臨床基因擴增檢查的實驗室。臨床基因擴增檢查實驗室設立在二級以上醫(yī)院。第四條臨床基因擴增檢查實驗室必須使用經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局同意的臨床檢查試劑開展臨床基因擴增檢查項目。第五條衛(wèi)生部臨床檢查中心（下列簡稱衛(wèi)生部臨檢中心）和省、自治區(qū)、直轄市臨床檢查中心（下列簡稱省臨檢中心）負責對所轄行政區(qū)域內(nèi)臨床基因擴增檢查實驗室的質(zhì)量監(jiān)督管理工作。第二章實驗室設立和驗收第六條擬設立臨床基因擴增檢查實驗室的醫(yī)療機構(gòu)按照《臨床基因擴增檢查實驗室基本設立原則》（見附件）籌建實驗室；籌建完畢后，由法定代表人向衛(wèi)生部臨檢中心提出技術(shù)驗收申請。申請時需提交下列材料：（一）《醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》復印件；（二）可行性研究報告；1、擬設臨床基因擴增檢查實驗室機構(gòu)的所在地醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、本機構(gòu)的基本狀況、對臨床基因擴增檢查的需求以及臨床基因擴增實驗室運行的預測分析；2、擬設臨床基因擴增檢查實驗室的設立平面圖；3、擬設臨床基因擴增檢查實驗室將開展的檢查項目、實驗設備條件和有關(guān)技術(shù)人員資料第七條衛(wèi)生部臨檢中心和省臨檢中心共同組織有關(guān)專業(yè)的專家組（下列簡稱專家組），按照《臨床基因擴增檢查實驗室基本設立原則》對提出申請的臨床基因擴增檢查實驗室進行技術(shù)驗收。驗收完畢后，在20日內(nèi)將驗收報告寄送至申請機構(gòu)。第八條經(jīng)專家組技術(shù)驗收合格的醫(yī)療機構(gòu)將本方法第六條規(guī)定的材料及專家組驗收報告送至省級行政部備案。在將符合規(guī)定的全部材料送達省級衛(wèi)生行政部門后15日內(nèi)未收到省級衛(wèi)生行政部門不同意的意見，方可開展專家組技術(shù)驗收合格的臨床基因擴增檢查項目。第九條未經(jīng)專家組驗收合格并報省級衛(wèi)生行政部門備案的醫(yī)療機構(gòu)不得私自開展臨床基因擴增檢查項目。第三章實驗室監(jiān)督管理第十條臨床基因檢查實驗室必須按照《臨床基因擴增檢查實驗室工作規(guī)范》（另發(fā)）開展臨床基因擴增檢查工作。第十一條臨床基因擴增檢查實驗室技術(shù)人員必須進行上崗培訓。經(jīng)培訓合格者，由培訓單位發(fā)給合格證書，并將培訓合格人員名單報衛(wèi)生部臨檢中心備案。獲得培訓合格證書者方可從事臨床基因擴增檢查工作。培訓單位為衛(wèi)生部臨檢中心，或由省級衛(wèi)生行政部門指定并經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心認定的機構(gòu)。培訓時使用規(guī)定的統(tǒng)一教材。第十二條以科研為目的的基因擴增檢查項目。不得向臨床出具檢查報告，不得向病人收取任何費用。第十三條臨床基因擴增檢查實驗室必須按照《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》開展室內(nèi)質(zhì)量控制，并參加衛(wèi)生部臨檢中心組織的室內(nèi)質(zhì)量評價。第十四條衛(wèi)生部臨檢中心按照本辦法和《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》協(xié)調(diào)、組織省臨檢中心對臨床基因擴增檢查實驗室的檢查質(zhì)量進行監(jiān)測。監(jiān)測成果報省級衛(wèi)生行政部門，同時抄送被監(jiān)測的臨床基因擴增檢查實驗室所在醫(yī)療機構(gòu)。第十五條衛(wèi)生部臨檢中心或省級臨檢中心受省級以上衛(wèi)生行政部門委托可對臨床基因擴增檢查實驗室進行現(xiàn)場檢查，現(xiàn)場檢查工作人員在推行職責時應出示證件。在進行現(xiàn)場檢查時，檢查人員有權(quán)調(diào)閱有關(guān)資料，被檢查機構(gòu)不得回絕或隱瞞。第十六條衛(wèi)生部臨檢中心對在室間質(zhì)量評價中不合格的臨床基因擴增檢查實驗室提出警告，對持續(xù)二次或三次中有二次發(fā)現(xiàn)臨床基因擴增檢查成果不合格的臨床基因擴增檢查實驗室，衛(wèi)生部臨檢中心報省級以上衛(wèi)生行政部門由省級以上衛(wèi)生行政部門責令其暫停有關(guān)臨床基因擴增檢查項目，限期整治。經(jīng)專家組進行再次技術(shù)驗收并合格，并報省級衛(wèi)生行政部門核準后，方可重新開展臨床基因擴增檢查項目。第十七條對于未經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心組織的專家組技術(shù)驗收合格并報省級衛(wèi)生部門備案，私自開展臨床基因檢查項目的醫(yī)療機構(gòu)，由省級衛(wèi)生行政部門根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)管理條例》第四十七條和《醫(yī)療機構(gòu)管理條例實施細則》第八十條予以處分，并予以公示。公示所需費用由被公示機構(gòu)支付。第十八條出現(xiàn)下列狀況之一的臨床基因擴增檢查實驗室，由省級衛(wèi)生行政部門責令其停止開展臨床基因擴增檢查，并對其所在醫(yī)療機構(gòu)予以公示。公示所需費用由被公示機構(gòu)支付：（一）開展超出衛(wèi)生部臨檢中心組織的技術(shù)驗收合格并報省級衛(wèi)生行政部門備案臨床基因擴增檢查項目的；（二）使用未經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局同意的試劑開展臨床基因擴增檢查的；（三）在臨床基因擴增檢查中未開展室內(nèi)質(zhì)量控制的；（四）在臨床基因擴增檢查中未參加室間質(zhì)量評價的；（五）在臨床基因擴增檢查中弄虛作假的；（六）以科研為目的的基因擴增檢查項目向病人收取費用的；（七）使用未經(jīng)培訓合格的專業(yè)技術(shù)人員從事臨床基因擴增檢查的；第四章附則第十九條對采供血機構(gòu)的基因擴增檢查實驗室開展基因擴增檢查項目的管理，參考本方法執(zhí)行。第二十條衛(wèi)生部臨檢中心組織的專家組對申請開展臨床基因擴增檢查的實驗室進行技術(shù)驗收所需費用按國家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。第二十一條本方法由衛(wèi)生部負責解釋。第二十二條本方法自公布之日起施行。附：臨床基因擴增檢查實驗室基本設立原則根據(jù)《臨床檢查擴增檢查實驗室管理暫行方法》，制訂本原則一、臨床基因擴增檢查實驗室區(qū)域設立原則（一）臨床基因擴增檢查實驗室區(qū)域設立原則1、試劑儲存和準備區(qū)2、標本制備區(qū)3、擴增反映混合物配制和擴增區(qū)4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動分析儀，區(qū)域可適宜合并。（二）各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。（三）進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區(qū)—>標本制備區(qū)—>擴增反映混合物配制和擴增區(qū)—>擴增產(chǎn)物分析區(qū)。（四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。二、工作區(qū)域儀器設備配備原則（一）試劑儲存和準備區(qū)1、2-8C和-15C冰箱2、混勻器3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）4、移動紫外燈（近工作臺面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓解決的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）6、專用工作服和工作鞋7、專用辦公用品（二）標本制備區(qū)1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱2、高速臺式冷凍離心機3、混允器4、水浴箱或加熱模塊5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）6、可移動紫外燈（近工作臺面）7、超凈工作臺8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓解決的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）9、專用工作服和工作鞋10、專用辦公用品如需解決大分子DNA，應含有超聲波水浴儀。（三）擴增反映混合物配制和擴增區(qū)1、核酸擴增儀2、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）3、可移動紫外燈（近工作臺面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓解決的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）5、專用工作服和工作鞋6、專用辦公用品(四)擴增產(chǎn)物分析區(qū)視檢查辦法不同而定?；緝x器設備以下：1、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）2、可移動紫外燈（近工作臺面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）4、專用工作服和工作鞋5、專用辦公用品臨床基因擴增檢查實驗室工作規(guī)范為使基因擴增檢查技術(shù)有效地應用于臨床，更加好地為疾病的防止、診療和治療服務，確保檢查質(zhì)量，特制訂本規(guī)范。一、臨床基因擴增檢查實驗室的規(guī)范化設立及其管理臨床基因擴增檢查實驗室的規(guī)范化設立詳見《臨床基因擴增檢查實驗室管理暫行方法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[]10號文)附件《臨床基因擴增檢查實驗室基本設立原則》。為避免污染，必須嚴格遵照《臨床基因擴增檢查實驗室設立原則》設立臨床基因擴增檢查實驗室。臨床基因擴增檢查實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設備。各區(qū)域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設備物品發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵照單一方向次序，即只能從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反映混合物配制和擴增區(qū)(簡稱擴增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，方便于鑒別。另外，當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。清潔辦法不當也是污染發(fā)生的一種重要因素，因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應有其各自的清潔用品以避免交叉污染。(一)試劑貯存和準備區(qū)下述操作在該區(qū)進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反映混合液的制備。貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運輸至試劑貯存和準備區(qū)，不能通過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反映混合液的離心管或試管前，應將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反映管吸液而造成污染。含反映混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反映取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)普通在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反映數(shù)來決定。主反映混合液的構(gòu)成成分特別是聚合酶的合用性和穩(wěn)定性通過預實驗來檢查，評價成果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(shù)(在第一種高溫變性環(huán)節(jié)后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反映混合液中。在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。另外，操作中使用一次性帽子也是一種有效地避免污染的方法。嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓解決。工作結(jié)束后必須立刻對工作區(qū)進行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常核心，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完畢后調(diào)至實驗臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最佳是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常統(tǒng)計。(二)標本制備區(qū)下述操作在該區(qū)進行：臨床標本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反映管和測定RNA時cDNA的合成。要對的使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)憤怒溶膠所致的污染，因此應避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動?？赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反映混合液的反映管。對含有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本解決和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別解決并作出統(tǒng)計。對實驗臺適宜的紫外照射(254nm波長，與工作臺面近距離)適合于滅活去污染?？梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充足照射。樣本解決對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取辦法，可在開展臨床標本檢測前對提取辦法進行評價。用于RNA擴增檢測的樣本制備好后來，應立刻進行cDNA合成，由于cDNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為確保逆轉(zhuǎn)錄反映的需要，應在標本制備區(qū)設立一種以上的溫育裝置。cDNA合成的抱負溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反映緩沖液條件下含有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性減少。待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進行PCR擴增。(三)擴增區(qū)下述工作在本區(qū)內(nèi)進行：DNA或cDNA擴增。另外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反映混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反映混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測定中，普通在第一輪擴增后必須打開反映管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。不能從本區(qū)再進入任何"上游"區(qū)域，可減少本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應在超凈臺內(nèi)進行。打開預解決過的反映混合液時必須避免液體濺出，特別是在巢式擴增環(huán)節(jié)之間。一種簡樸的辦法是在打開反映管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也含有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。完畢操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射辦法與前面區(qū)域相似。如有溶液濺出，必須解決并作出統(tǒng)計。(四)擴增產(chǎn)物分析區(qū)下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。核酸擴增后產(chǎn)物的分析辦法多個多樣，如膜上或微孔板上探針雜交辦法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序辦法等。現(xiàn)在國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交辦法，即PCR-ELISA辦法，也有膜上探針雜交辦法。本區(qū)是最重要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA辦法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/LHC1中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/LHCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序解決，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應注意實驗人員的安全防護。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射辦法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負壓條件或減壓狀況下(如安裝排電扇)可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。二、臨床基因擴增檢查實驗室質(zhì)量確保臨床基因擴增檢查實驗室質(zhì)量確保涉及到整個基因擴增檢查的全部階段，即測定分析前的標本采集解決、測定中的核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析以及測定后的成果報告等。(一)標本的采集慣用于基因擴增檢測的臨床標本涉及EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應使用一次性密閉容器，如真空采血管。當使用非密閉采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意避免來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應高壓解決，由于玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最佳是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必須進行抗凝解決。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，由于肝素是Taq酶的強克制劑，并且在其后的核酸提取環(huán)節(jié)中很難去除。臨床用于RNA(如HCVRNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝解決，并盡快(3小時以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝解決，則抽血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。(二)標本的穩(wěn)定化解決用于DNA擴增檢測的標本，采集后普通不需要特殊的穩(wěn)定化解決，但標本應及時送至實驗室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩(wěn)定化解決，如流行病學調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidinethiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立刻失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/LGITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化解決后，標本普通不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化解決辦法的效果終究如何，要使用對應的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定辦法來評價。(三)標本的運輸標本采集后必須盡快送至實驗室。通過適宜穩(wěn)定化解決的標本可在常溫下通過郵寄運輸。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經(jīng)GITC穩(wěn)定化解決的標本。普通在運輸時，應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化解決，則必須速凍后，放在干冰中運輸。(四)標本的貯存臨床體液標本如血清/血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/LTris-1mmol/LEDTA緩沖液(pH中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC解決的RNA標本在室溫可保存7天。(五)標本的解決(核酸提取)標本解決即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的核心性環(huán)節(jié)，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應對其進行充足評價以驗證其提取的有效性。普通，核酸制備質(zhì)量不高是由于克制物去除不完全所致，克制物可能來源于標本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過程中殘留的有機溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對其后的Taq酶擴增反映環(huán)節(jié)含有強烈的克制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時，則必須先進行液化解決，再提取核酸。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。另外，當靶核酸為RNA時，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見因素是標本在運輸前未經(jīng)充足的穩(wěn)定化解決及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的環(huán)節(jié)，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實驗室則應回絕接受標本，規(guī)定重新采用標本，并對運輸者給以具體的指導。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴增1、靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一種酶反映環(huán)節(jié)，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈，為背面擴增的模板。下述因素普通影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的減少或完全缺少。其可能的因素有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的克制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在造成RNA的降解。2、核酸的擴增有多個因素可引發(fā)核酸擴增檢測的假陽性或假陰性成果，如擴增靶核酸中克制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要，必須定時對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查，以避免假陰性成果。(七)污染在實際工作中，常見有下列幾個污染類型：擴增片段的污染(產(chǎn)物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標本間交叉污染(如氣溶膠從一種陽性標本擴散到原本陰性的標本)。臨床基因擴增檢查實驗室中污染的最重要來源是擴增產(chǎn)物的污染。由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時并且還很繁瑣，因此避免污染重在防止。但如果發(fā)生了污染，實驗就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實驗成果必須作廢。1、測定分析前的污染源測定分析前實驗材料的污染重要來自非病人標原來源的核酸。2、測定分析階段的污染源普通，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。反映混合液的任何成分及核酸的制備和反映建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反映管，吸頭)和實驗設備(如加樣器、離心機)等。在前面三個工作區(qū)中，不當?shù)膶嶒灢僮鲿l(fā)所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒炘O備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當吸取擴增產(chǎn)物用于檢測時，非常容易引發(fā)污染，因此必須制訂原則操作程序(SOP)，并嚴格執(zhí)行。3、污染的避免要避免污染，首先應是防止而不是排除污染，前面所述對工作區(qū)的嚴格劃分的目的即是為了防止污染。為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物的污染，可設法將其破壞掉。如在擴增反映中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反映混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來自以前測定的擴增產(chǎn)物，從而避免其對后來要進行的擴增測定的污染。另外一種辦法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補骨脂素光化學產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反映但又不妨礙PCR后雜交過程，因此這種辦法也能避免污染。上述防污染辦法只在一定程度上有效，因此不能用其來替代嚴格的實驗室設立和管理，特別是這些辦法不能避免外來非擴增的天然DNA的污染。4、去除污染的方法工作完后必須定時對實驗室采用有效的去污染方法，結(jié)合多個不同的辦法可達成最佳效果。去污染方法涉及但不僅限下面幾個：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)實驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其它表面；(3)實驗設備如加樣器的高壓消毒。(八)擴增產(chǎn)物的分析擴增產(chǎn)物的測定有多個辦法，如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢查項目基本上都使用探針雜交辦法。雜交成果不充足的因素可能是基因探針不適宜、標記辦法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌辦法不適宜等。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。探針的標記物慣用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。在擴增后的雜交檢測中,應當嚴格恪守商品試劑盒擬定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會減少雜交的嚴格性，還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反，提高溫度和/或減少離子強度會增加雜交的嚴格性。因此，嚴密控制溫度和試劑的離子強度是避免假陽性和假陰性成果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強度不能同時變化。(九)質(zhì)量控制質(zhì)量控制涉及兩個方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制(下列簡稱質(zhì)控)和室間質(zhì)量評價。1、室內(nèi)質(zhì)量控制必須對DNA和RNA分析的各步進行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，確保測定成果的精確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性，因此標本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都規(guī)定有質(zhì)控方法。(1)標本制備：慣用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA與否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取辦法制備的DNA的平均長度普通為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范疇為30-40kb。明顯出現(xiàn)降解的DNA(在1和10kb的低分子量范疇內(nèi))在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘目酥苿┻M行質(zhì)控(在克制劑存在的狀況下，高分子量的片段不被酶切)。潛在的克制劑的存在普通用260nm和280nm的分光光度測定來預計，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/A280比值應當在~之間;否則,殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色辦法不能對DNA的完整性下結(jié)論。最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的辦法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點跟DNA分離相似。但如果對成果有疑問,就應當在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在抱負狀況下,三種重要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價的實驗室內(nèi)的原則；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評定也是RNA完整性的適宜的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些因素，單獨的光度計比色辦法也不能對RNA的完整性下結(jié)論。對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價標本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽狀況下標本解決辦法對擴增檢測的影響，避免由于標本解決辦法的不當而出現(xiàn)假陰性成果。另外，還可采用已知濃度標本評價核酸提取辦法的效果。(2)逆轉(zhuǎn)錄和擴增：本部份涉及陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。對逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標質(zhì)控辦法也可采用外標質(zhì)控辦法。逆轉(zhuǎn)錄-擴增檢測的內(nèi)標普通為在整個細胞周期中均勻體現(xiàn)的mRNA，如HLA、β肌動蛋白和組蛋白的mRNA或14SrRNA等。另外，也可在標本制備時將外來內(nèi)標加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴增。當標本中存在逆轉(zhuǎn)錄克制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標即會體現(xiàn)為陰性成果。對于DNA測定內(nèi)標可使用對有機體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測，內(nèi)標多采用人工制備的競爭性內(nèi)標。內(nèi)標能夠監(jiān)控每一擴增孔中假陰性的產(chǎn)生狀況?，F(xiàn)在的商品試劑盒大部分沒采用內(nèi)標辦法質(zhì)控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBVDNA、HCVRNA等時，應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測臨床標本等同解決提取核酸及擴增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴增檢測的效果。使用這些外加弱陽性質(zhì)控不僅可檢測擴增反映液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質(zhì)控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相似的主反映混合液。每一種PCR實驗中都必須設有外加陰性質(zhì)控(污染監(jiān)測質(zhì)控)，為判斷擴增過程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可涉及以下幾個，即在樣品制備的整個過程中所帶的空白管、僅有擴增反映液但不含擴增模板的反映管、陰性標本等。陰性標本能夠評定PCR實驗的綜合質(zhì)量。在擴增靶RNA的RT-PCR實驗中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過這種辦法，可發(fā)現(xiàn)以前擴增的DNA片段所引發(fā)的污染。(3)板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應當在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反映中因使用不同雜交條件所致的對成果的錯誤解釋。(4)測定成果的評價與報告：采用實時熒光定量PCR檢測辦法，在判斷成果時，應先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免某些非特異熒光信號對成果分析的干擾。成果的報告必須簡樸清晰。定性測定報告"陽性"或"陰性"即可。定量測定則必須報告量的多少，如成果高于測定辦法線性范疇上限，則對樣本稀釋后再測，成果乘上稀釋倍數(shù)；如成果低于辦法的測定范疇下限，則報?lt;多少即可，不能報告為"0"或"陰性"。2、室間質(zhì)量評價全部開展臨床基因擴增檢查的實驗室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢查中心組織的全國臨床基因擴增檢查項目的室間質(zhì)量評價，評價成果將作為其開展臨床基因擴增檢查的根據(jù)之一。本工作規(guī)范自公布之日起實施。如何迎接臨床基因擴增檢查實驗室技術(shù)驗收陶志華（溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢查科）臨床基因擴增檢查實驗室重要應用把PCR（聚合酶鏈反映）技術(shù)應用于疾病的診療與治療監(jiān)測。PCR技術(shù)發(fā)明是生物醫(yī)學領域的一項革命性創(chuàng)舉，含有深遠歷史意義，但在上世紀九十年代中國，在我國由于部分醫(yī)部機構(gòu)受利益的驅(qū)動，在缺少技術(shù)、設備以及規(guī)范化管理的狀況下，PCR技術(shù)臨床應用泛濫，出現(xiàn)大量假陽性和假陰性成果，甚至出現(xiàn)虛假檢測報告，造成檢查成果和臨床意義應用十分混亂，嚴重擾亂正常醫(yī)療秩序，特別在性病基因檢測方面，甚至還帶來一系列道德倫理、家庭糾紛以及社會和法律問題。PCR技術(shù)臨床應用所出現(xiàn)的一系列問題引發(fā)衛(wèi)生部管理層高度重視，衛(wèi)生部醫(yī)政司于1988年下發(fā)了衛(wèi)醫(yī)發(fā)[1998]9號文獻宣布PCR技術(shù)暫停應用于臨床診療。通過近四年重復論證，衛(wèi)生部1月14日公布“臨床基因擴增檢查實驗室管理暫行方法”，同年2月20日衛(wèi)生部臨床檢查中心公布“臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范”。兩個文獻宣布了PCR技術(shù)臨床應用解凍，明確規(guī)定臨床基因擴增檢查實驗室開展PCR技術(shù)必需含有的基本條件：①規(guī)范的PCR實驗室②編寫適合本實驗室的質(zhì)量手冊③經(jīng)PCR專業(yè)知識培訓的技術(shù)人員（PCR上崗證）④使用有生產(chǎn)批文的PCR試劑。含有條件的二級以上醫(yī)院可向衛(wèi)生部或省臨床檢查中心申請技術(shù)驗收。本人作為通過衛(wèi)生部臨床檢查中心驗收的臨床基因擴增檢查實驗室一名實驗室工作人員，同時也作為專家多次參加衛(wèi)生部臨床檢查中心組織的實驗室驗收，就臨床基因擴增實驗室技術(shù)驗收的前期準備工作和現(xiàn)場技術(shù)驗收整個過程作一簡樸介紹，并談談本人體會。一、為什么要進行臨床基因擴增檢查實驗室技術(shù)增收臨床基因擴增實驗室采用PCR技術(shù)用于臨床基因診療，由于PCR技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現(xiàn)實驗室污染造成臨床檢測標本假陽性成果；另外由于PCR技術(shù)規(guī)定高、影響因素多（特別是RNA標本），實驗過程解決不當易造成核酸模板無擴增現(xiàn)象，造成臨床標本假陰性成果。因此臨床基因擴增檢查實驗室技術(shù)驗收和規(guī)范化管理是PCR技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應用該技術(shù)前提。二、PCR實驗室驗收準備工作（一）硬件準備——實驗室基本建設1.根據(jù)文獻規(guī)定，臨床基因擴增檢查實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)；標本制備區(qū)；擴增反映混合物配制和擴增區(qū)；擴增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。2.各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。3.進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一流向進行，即試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反映混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。4.不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。5.工作區(qū)域儀器設備配備原則（1）試劑貯存和準備區(qū)2～8℃和-15℃冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓解決的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（2）標本制備區(qū)2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速臺式冷凍離心機；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；超凈工作臺，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓解決的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（3）擴增反映混合物配制和擴增區(qū)核酸擴增儀；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓解決的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（4）擴增產(chǎn)物分析區(qū)視檢測辦法不同而定。基本儀器設備以下：微量加樣器（覆蓋1～200μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓解決的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（二）軟件建設——質(zhì)量手冊編寫與實施、人才資源（上崗證培訓與有關(guān)知識學習）1.臨床基因擴增檢查實驗室的質(zhì)量手冊編寫質(zhì)量手冊是闡明臨床基因擴增檢查實驗室的質(zhì)量方針，并描述過其質(zhì)量體系的文獻。質(zhì)量手冊規(guī)定了質(zhì)量體系的基本構(gòu)造，是實施和保持質(zhì)量體系應長久遵照的文獻。臨床基因擴增檢查實驗室質(zhì)量手冊編寫應根據(jù)衛(wèi)生部下發(fā)兩個文獻，并結(jié)合本實驗室實際狀況編寫適合本實驗室的切實可行的質(zhì)量手冊。質(zhì)量手冊的提綱應涉及三部分：質(zhì)量方針和宗旨；工作制度；原則操作文獻（SOP）（1）質(zhì)量方針和宗旨制訂臨床基因擴增檢查實驗室的質(zhì)量管理目的和質(zhì)量確保體系的構(gòu)造體系和總方針。（2）工作制度普通應涉及下列文獻：實驗室的設立、布局及組織構(gòu)造；實驗室內(nèi)務管理制度；實驗室的人員配備及管理制度；生物的防護與安全制度；實驗室廢棄物解決制度；實驗室清潔消毒制度；儀器設備的管理制度；儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度；臨床標本的管理制度；實驗室統(tǒng)計的管理制度；質(zhì)量控制工作管理制度；成果報告管理制度；埋怨的內(nèi)部解決制度；負責人及質(zhì)檢員職責；崗位設立和責任制等……（3）原則操作程序（SOP）普通涉及：消毒液配制原則操作程序：消毒原則操作程序；超凈工作臺使用原則操作程序；超凈工作臺維護和保養(yǎng)原則操作文獻；PCR儀使用原則操作程序；PCR儀維護和保養(yǎng)原則操作程序；高速低溫離心機使用原則操作程序；移液器使用原則操作程序；冰箱維護和保養(yǎng)原則操作程序；電熱恒溫水浴箱操作程序；電子天平使用和校正操作程序；可移動紫外消毒車使用操作程序；加樣器校準原則操作程序；離心機維護保養(yǎng)操作程序；溫度計校準程序；試劑的質(zhì)檢操作程序；標本唯一標記編號編制規(guī)則；臨床標本的采集及解決操作程序；臨床標本的保存程序；乙肝病毒核酸擴增熒光檢測原則操作程序；丙肝病毒核酸擴增熒光檢測原則操作程序；結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測原則操作程序；沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測原則操作程序等……（4）引用圖表：PCR擴增可接受標本統(tǒng)計表；PCR擴增拒收標本統(tǒng)計表；室內(nèi)質(zhì)控成果統(tǒng)計表；室間質(zhì)控統(tǒng)計表；消耗性材料驗收統(tǒng)計表；試劑驗收統(tǒng)計表；故障解決表；臺階式高速離心機使用統(tǒng)計表；臺式高速冷凍離心機使用統(tǒng)計表；擴增儀維護保養(yǎng)統(tǒng)計表；人員培訓計劃及培訓統(tǒng)計表；實驗室工作人員一覽表；重要設備一覽表；實驗室清潔消毒統(tǒng)計表；工作區(qū)溫度、濕度統(tǒng)計表；埋怨統(tǒng)計表；標本超低溫保存統(tǒng)計表；應急解決統(tǒng)計表；垃圾解決統(tǒng)計表；冰箱溫度統(tǒng)計表；水浴箱溫度統(tǒng)計表；移動紫外消毒車統(tǒng)計表；設備校正統(tǒng)計表；檢測成果報告流程；報告單樣張；臨床送檢標本流程圖；實驗室組織構(gòu)造圖。三、臨床基因擴增檢查實驗室技術(shù)驗收申請（1）填寫臨床擴增檢查實驗室技術(shù)驗收申請表（a）基因擴增檢查實驗室基本狀況涉及檢查科基本狀況特別是基因擴增檢查實驗室基本運行狀況，必要性與可行性，著重分析開展項目運行狀況、人員配備現(xiàn)狀、內(nèi)部質(zhì)量管理體系執(zhí)行狀況與效果分析。（b）應提供資料醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證；擬設立基因擴增檢查實驗室醫(yī)院的醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、對臨床基因擴增檢查的需求狀況以及實驗室運行的預測分析；擬設基因擴增檢查實驗室的設立平面圖；實驗室重要負責人簡歷表；實驗室工作人員一覽表（附實驗室工作人員簡歷）；重要儀器設備表；擬開展的臨床基因診療項目；臨床基因診療質(zhì)量手冊；檢查報告單2份。（c）但愿驗收時間根據(jù)本實驗室建設進展狀況和試運行進展，提出大致的現(xiàn)場技術(shù)驗收時間。（d）聲明志愿申請，承當兩義務：恪守《臨床基因擴增檢查實驗室管理暫行方法》和《臨床基因診療實驗室工作規(guī)范》及有關(guān)規(guī)定；不管能否獲準通過驗收，預付驗收階段的全部費用。（2）衛(wèi)生部或省臨床檢查中心預審對申報文獻和現(xiàn)場進行預驗收，初步擬定與否進行現(xiàn)場驗收和驗收時間。四、現(xiàn)場技術(shù)驗收衛(wèi)生部臨床檢查中心臨床基因擴增檢查實驗室技術(shù)任務書現(xiàn)場技術(shù)專家構(gòu)組員構(gòu)成技術(shù)驗收工作日程表驗收組預備會初次會議現(xiàn)場驗收實驗室設立及儀器設備配備狀況實驗室原則操作程序文獻有關(guān)統(tǒng)計現(xiàn)場考核現(xiàn)場實驗驗收組全體會議擬定驗收結(jié)論和驗收報告末次會議驗收組宣布驗收結(jié)論實驗室負責人講話５.臨床基因擴增檢查實驗室驗收體會（１）對驗收文獻的學習不夠、理解不深，造成編制程序性文獻偏離，應對照驗收規(guī)定逐條貫徹，切實可行。（２）目的性認識局限性：受老觀念的影響，總覺得實驗室技術(shù)驗收準備工作是為專家而準備的，沒意識到這是本實驗室檢查質(zhì)量的內(nèi)在需要，覺得只要通過專家現(xiàn)場驗收，拿到合格證書就萬事大吉了。（３）質(zhì)量控制意識不強我們編寫的質(zhì)量手冊的目的是規(guī)范實驗操作整個過程，做到實驗過程有章可循，實驗統(tǒng)計有據(jù)可查，確保明驗成果的可靠性和精確性。由于基因擴增技術(shù)特殊性，即使嚴格按質(zhì)量手冊進行操作，也難免出現(xiàn)錯誤成果，因此還應當強化質(zhì)量控制意識。實驗過程中嚴格設立質(zhì)控標本，涉及試劑空白對照、陰性標本對照、臨界值陽性標本對照等，分別監(jiān)測試劑配制與加樣過程中與否存在污染？標本核酸模板提取過程中與否存在污染？標本檢測過程中與否存在假陰性成果和成果與否精確？等。但有些醫(yī)院由于考慮到多個實際問題而沒有較好貫徹，應引發(fā)高度重視。（4）程序文獻實施難問題在許多醫(yī)院，由于基因擴增檢查實驗室是現(xiàn)在大多檢查科唯一通過實驗室技術(shù)驗收的實驗室，可能受周邊其它實驗室不規(guī)范行為的干擾和存在人員配備方面問題，可能出現(xiàn)文獻貫徹方面問題，特別是原始標本的接受和統(tǒng)計方面。（5）工作量少影響質(zhì)量確保體系實施嚴格按臨床基因擴增檢查實驗室技術(shù)規(guī)定通過驗收的實驗室，存在一定運行成本，需要有一定臨床標本量的支持；如果某一醫(yī)院醫(yī)療資源局限性，標原來源局限性以支持運行成本時，就會想方設法去減少運行成本（涉及試劑成本和勞務成本），造成檢查質(zhì)量難以得到確保。因此建議欲建立臨床基因擴增檢查實驗室的單位，應充足考慮自己醫(yī)療資源狀況，擬定是自己建立臨床基因擴增檢查實驗室合算？還是外送標本合算？。同時衛(wèi)生部和省臨床檢查中心在初審應充足考慮這方面狀況，以及現(xiàn)場驗收專家應嚴加把關(guān)。以上僅代表本人的意見和見解，若有不當之處，請多多指正。摘自《華東區(qū)臨床檢查中心協(xié)作組臨床實驗室質(zhì)量管理及新技術(shù)應用高級研討會》臨床基因擴增實驗室質(zhì)量手冊的書寫許斌（江蘇省臨床檢查中心）1質(zhì)量管理的歷史1950年代臨床實驗室開始質(zhì)量控制（QualityControl,QC）;1980年代參考工業(yè)的GMP管理思路建立良好實驗室實踐準則（GoodLaboratoryPractice,GLP）；進入質(zhì)量確保（Qualityassurance,QA）；1990年代實驗室引入質(zhì)量體系認證及實驗室承認制度，實現(xiàn)全方面質(zhì)量管理（TQM，TotalQualityManagement）。質(zhì)量體系認證——ISO9000（）；實驗室承認——ISO/IEC原則17025-《校準和檢測實驗室資格的通用規(guī)定》；ISO/DIS原則15189-1999“醫(yī)學實驗室的質(zhì)量管理?！?美國臨床實驗室認證?發(fā)證機構(gòu)：HCFA（HealthGareFinancingAdministrations）,衛(wèi)生保健署?認證根據(jù)，CLOA38，行業(yè)承認，強制，體系+能力?認證中介機構(gòu)：*JCAHO（JointCommissiononAccreditationofHealthcareOrganizations）衛(wèi)生機構(gòu)承認聯(lián)合委員會*CAP(CollegeofAmericanPathologist)美國病理家學會*COLA（CommissiononOfficeLaboratory

Accred-itation）醫(yī)生實驗室承認委員會3我國實驗室合格評定?承認*根據(jù)：ISO/IEC17025，15189*國家評審，自愿，體系+能力?認證*根據(jù)：ISO9000：*中介機構(gòu)，自愿，體系?行業(yè)技術(shù)驗收*《臨床實驗室管理方法》，《江蘇省醫(yī)院檢查科建設與管理規(guī)范》*省、市臨床檢查中心，強制，體系+能力4PCR驗收意義及驗收根據(jù)開始的PCR實驗室驗收工作開創(chuàng)臨床檢查技術(shù)準入的先河、推動臨床實驗室原則化建設、規(guī)范檢測市場、建立醫(yī)療事故防止機制。其根據(jù)為：《臨床基因擴增檢查實驗室管理暫行方法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[]10號《臨床基因擴增檢查實驗室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[]8號《有關(guān)成立臨床基因擴增檢查專家組的告知》蘇衛(wèi)醫(yī)[]42號5規(guī)定應含有的SOP（13個）儀器設備的維護保養(yǎng)程序、儀器設備的校準程序、儀器設備的操作程序、臨床標本收集程序、臨床標本的解決（核酸純化）程序、臨床標本的保存程序、試劑的質(zhì)檢操作程序、消耗品購置驗收和儲存程序、廢棄物的解決程序、內(nèi)務管理程序、室內(nèi)質(zhì)量控制程序、核酸擴增及產(chǎn)物分析檢測的操作程序、埋怨解決程序。6質(zhì)量管理體系定義

在質(zhì)量方面指揮和控制組織的管理體系。（QualityManagementSystem）管理體系是指建立方針和目的并實現(xiàn)這些目的的體系。實驗室通過把組織機構(gòu)、職責、工作程序、質(zhì)量活動過程和各類資源、信息等協(xié)調(diào)統(tǒng)一起來所形成的有機整體即為實驗室的質(zhì)量體系。質(zhì)量體系的文獻構(gòu)成第一層：質(zhì)量手冊（大綱性文獻）；第二層：程序性文獻（體系要素的規(guī)定）；第三層：作業(yè)指導書（具體項目的操作指導）；第四層：統(tǒng)計涉及表格、簽名、原始統(tǒng)計、報告等質(zhì)量統(tǒng)計和技術(shù)統(tǒng)計。質(zhì)量手冊定義GB/T6583定義：質(zhì)量手冊是闡明一種實驗室的質(zhì)量方針，并描述質(zhì)量體系的文獻。它既是質(zhì)量體系的表征形式，又是質(zhì)量體系建立和運行的大綱。它對實驗室的組織構(gòu)造（含職責）、程序、活動能力（過程）和資源作出規(guī)定，是實驗室長久遵照的文獻。質(zhì)量手冊的分類根據(jù)手冊的內(nèi)容和用途分為二類：質(zhì)量確保手冊——用于證明，供客戶使用，質(zhì)量管理手冊——用于運行，供實驗室內(nèi)部使用。質(zhì)量手冊的作用編寫質(zhì)量手冊的健全和完善質(zhì)量體系的首要環(huán)節(jié)。根據(jù)實驗室的內(nèi)外因素合理調(diào)節(jié)、選擇體系要素，分派和貫徹質(zhì)量職責，理順管理關(guān)系，明確管理責任，合理安排各類文獻的層次，把實驗室積累的經(jīng)驗變成法規(guī)性文獻。協(xié)調(diào)各工作環(huán)節(jié)的準則。內(nèi)部質(zhì)量審核的根據(jù)；對外證明實驗室的質(zhì)量確保能力，提高客戶的信任度。質(zhì)量手冊的特性?以客戶為關(guān)注焦點：以病人為中心，為臨床服務?領導作用：發(fā)明使員工能夠充足參加實現(xiàn)目的的環(huán)境?全員參加：各負其責?過程辦法：將資源和活動作為過程進行有效管理?管理的系統(tǒng)辦法：各個過程的有效連接?持續(xù)改善：根據(jù)實際不停完善?基于事實的決策辦法：遵照科學，實事求是出報告?與供方互利的關(guān)系：互相協(xié)作，共同獲利質(zhì)量手冊的構(gòu)造?封面?同意頁：涉及實驗室名稱、標志，發(fā)行版次，生效日期，同意人簽名，手冊編號，受控狀態(tài)。?實驗室公正性聲明?修訂頁：以表格描述修訂序號、修訂的章節(jié)條款和簡要內(nèi)容、同意人及日期。?目錄：各章節(jié)條款的名稱及頁碼?前言：介紹實驗室的普通狀況和手冊的合用范疇以及手冊中術(shù)語或縮略語的定義?手冊的管理：對手冊的保存、分發(fā)、評審、修訂以及保密作出規(guī)定?質(zhì)量方針及目的?組織構(gòu)造及人員責權(quán)利關(guān)系?要素描述：由系列SOP文獻對溯源、人、機、料、樣、法、測等質(zhì)量諸要素的陳說?支持性文獻：涉及實驗室平面圖、人員一覽表、儀器設備一覽表、引用原則及參考文獻等原則操作程序StandardOperationalProcedure,簡稱SOP。程序的定義為：為進行某項活動所規(guī)定的途徑。SOP是臨床實驗室內(nèi)部以文獻的形式對質(zhì)量活動用規(guī)定的辦法進行持續(xù)而恰當?shù)目刂?。實驗室的SOP應涵蓋全部的質(zhì)量活動，涉及檢測或校準計劃、管理性程序、技術(shù)性程序、項目操作程序和統(tǒng)計表格等。由于影響每個實驗室的質(zhì)量活動的條件和因素不同，一種SOP只在某個實驗室內(nèi)有效，而不一定合用于其它實驗室。原則操作程序的普通規(guī)定?對