不同藥物降壓對腎性高血壓大鼠imd基因表達(dá)的影響

不同藥物降壓對腎性高血壓大鼠imd基因表達(dá)的影響

1imd在高血壓心肌組織及病理生理中的作用中介素（imd）是roh和geti發(fā)現(xiàn)的相同物質(zhì)，屬于減少鈣基因（cacliman）相關(guān)的基因（calciman）家族的成員。imd磁共振成像可廣泛存在于中樞神經(jīng)和周圍器官。IMDmRNA在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的肥厚心肌中表達(dá)增加,有報(bào)道給自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneoushypertensiverat,SRH)持續(xù)、大劑量地靜脈注入IMD,可降低平均動脈壓和抑制心肌功能、減輕心肌肥厚,所以人們推測IMD在高血壓肥厚心肌細(xì)胞中代償性的升高,并具有降壓擴(kuò)血管作用和改善心肌肥厚的作用。在一氧化氮合酶抑制劑誘導(dǎo)的壓力超負(fù)荷模型的左室心肌細(xì)胞中,IMD及其受體成分(CLR、RAMP1,RAMP2,RAMP3)表達(dá)均明顯上調(diào),應(yīng)用肼屈嗪和或氫氯噻嗪使收縮壓恢復(fù)正常后,CLR、RAMP2,RAMP3的表達(dá)恢復(fù)正常,但I(xiàn)MD和RAMP1仍然高表達(dá),同時心肌厚度也未恢復(fù)正常,說明在此種高血壓動物模型中,IMD在高血壓心肌肥厚的病理生理過程中發(fā)揮重要作用,IMD的作用與心肌壓力超負(fù)荷無關(guān)。但是這未能證明在所有的高血壓動物模型中IMD變化規(guī)律,本實(shí)驗(yàn)旨在研究腎血管性高血壓大鼠肥厚心肌中IMD表達(dá)的規(guī)律,及纈沙坦、氨氯地平和依那普利對此的干預(yù)作用。2材料和方法2.1動物高血壓的形成選用健康雄性SD大鼠(280～320g,四川省中醫(yī)藥研究所)。實(shí)驗(yàn)前至少適應(yīng)性籠養(yǎng)10d以上,室溫21℃,自由飲水和進(jìn)食。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30mg·kg-1)。動物取右側(cè)臥位,暴露左腎區(qū),在左肋弓下距離脊柱0.5cm處作一切口,入腹膜后探出左腎,分離左腎動脈,將直徑為0.22mm的針灸針放置在左腎動脈上,用手術(shù)縫線結(jié)扎,抽出針灸針,縫合關(guān)閉創(chuàng)口,讓大鼠從麻醉狀態(tài)下蘇醒。假性手術(shù)組分離左腎動脈,僅用手術(shù)縫線繞過,不予結(jié)扎,余下操作與以上模型組相同。以術(shù)后血壓超過140mmHg時即確定動物高血壓形成,并用于藥物實(shí)驗(yàn)。所有動物術(shù)后飼養(yǎng)于清潔級動物實(shí)驗(yàn)室,自由取食與飲水。2.2尾動脈血壓測定采用RBP—III型大鼠血壓心率儀(中日友好醫(yī)院),應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)尾套法在大鼠清醒狀態(tài)下測定尾動脈血壓。測量前大鼠在預(yù)熱箱中34℃下預(yù)熱10～15min。測量時間設(shè)置在每天上午8∶00-12∶00,每只至少測定3次,取3次結(jié)果的平均值作為血壓數(shù)值。在術(shù)后第1個月每周至少測定血壓一次,以后2周測定血壓1次。2.3藥物干預(yù)及給藥劑量以收縮壓≥140mmHg為標(biāo)準(zhǔn)造模,成功后隨機(jī)分組成五組:(1)單純不完全結(jié)扎左側(cè)腎動脈(renalarteryconstructiongroup,RAC,n=8);(2)不完全結(jié)扎左側(cè)腎動脈+纈沙坦組(Valsartangroup,Val,n=7);(3)不完全結(jié)扎左側(cè)腎動脈+氨氯地平組(Amlodipinegroup,Aml,n=7);(4)不完全結(jié)扎左側(cè)腎動脈+依那普利組(Enalaprilgroup,Ena,n=8);(5)假性手術(shù)組(Shamoperationgroup,So,n=6)。以上藥物干預(yù)組于術(shù)后第5周開始,每周測量動物體重,開始給第2組纈沙坦30mg/(kg·d)),第3組氨氯地平5mg/(kg·d),第4組依那普利20mg/(kg·d),每組均每日給藥1次,連續(xù)給藥10周。各組藥物劑量的選擇參照文獻(xiàn),此劑量已被證實(shí)可降低腎性高血壓大鼠的血壓,并抑制左室心肌肥厚。以上各組分籠喂養(yǎng),藥物分別溶于蒸餾水中通過胃管灌飼給藥。假手術(shù)對照組及高血壓對照組給予同等容積的溶劑。對那些被不完全結(jié)扎但在術(shù)后第4周末血壓仍未升高的大鼠,將在給藥前從藥物實(shí)驗(yàn)中剔除。在給藥時間結(jié)束之時,再次測量動物體重和血壓。2.4go-dt/dt的制備MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及dNTP、Tag酶、Oligo(dT)15primer、擴(kuò)增的寡核苷酸引物均由上海生工生產(chǎn),日本產(chǎn)OLYMPUS顯微鏡;顯微鏡目鏡測微尺系上海第三光學(xué)儀器廠產(chǎn)品。2.5心肌細(xì)胞橫徑檢測開胸摘取心臟在預(yù)冷(0～4℃)的DEPC處理的水中洗去心腔中殘血,用濾紙(DEPC處理)將心臟表面水吸干,剪去左右心房及右心室,即所得左心室,計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(mg/g)=左心室重量/體重。稱重后取兩份,一份固定在4%多聚甲醛中過夜,行常規(guī)石蠟包埋,以用作心肌細(xì)胞橫徑的測量;另一份用于左心室IMDmRNA的測定。2.6心肌細(xì)胞橫徑檢測沿冠狀面于心臟最大橫徑處分別切取約3mm厚的左室游離壁心肌,常規(guī)制作HE切片。在蘇木精(Hatmatoxylin)-伊紅(Eosin)染色(HE)切片上,用顯微鏡目鏡測微尺測量左室心肌細(xì)胞橫徑(Leftventriculartransectiondiameter,VTDM)每張切片先在低倍鏡下觀察左室游離壁,然后高倍鏡下(10×40)在心肌縱斷面隨機(jī)選取20個胞漿橫紋清晰、胞核完整、形狀規(guī)則的心肌細(xì)胞,應(yīng)用SPOTVERSION4.6顯微圖像分析軟件測量有核處橫徑,取其均值為該例的LVTDM。2.7pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)心肌組織總RNA提取和IMDmRNA的測定用Trizol一步法提取上述所剩余心肌組織總RNA、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及Oligo(dT)15primer逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。PCR反應(yīng)體系25μl:cDNA1μl、IMDprimerF0.5μl,IMDprimerR0.5μl,2.5mmol/ldNTP2μl,TagDNA聚合酶0.2單位,2.5mmol/LdTNP1μl,含15mmol/LMgCl2的10×PCR緩沖液2.5μl,反應(yīng)條件:94℃變性5min,然后94℃30s,55℃30s,熱循環(huán)30次,72℃40s。取1μlcDNA產(chǎn)物,以β-actin為引物,反應(yīng)條件為:94℃變性5min,然后94℃30s,55℃30s熱循環(huán)24次,72℃40s。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(半定量RT-PCR):RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上經(jīng)100V恒壓電泳30min后,溴乙錠染色后取出該凝膠,在凝膠分析系統(tǒng)上拍照,定量掃描儀分別獲得376bp和446bp條帶,分析各樣本擴(kuò)增條帶的光密度值,將各目的基因擴(kuò)增條帶的光密度數(shù)據(jù)分別與β-actin基因的光密度數(shù)據(jù)相比得出各樣本的光密度相對比值,即為IMDmRNA的相對含量。IMDmRNAPCR反應(yīng)條件(見表1)。2.8b分析結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSSforWindows13.0)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,各組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。組間比較采用單因素方差(One-wayANOVA)分析,Student-Newman-Keuls(SNK)方法檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性。3結(jié)果3.1心率變化情況取樣前Val組、Aml組和Ena組體重較RAC組明顯升高(P<0.05),并較So組明顯降低(P<0.05)。心率各組無差異(P=0.110),取樣前與結(jié)扎前無差異。各組結(jié)扎前血壓無差異,取樣前單純結(jié)扎組收縮壓較結(jié)扎前明顯升高,用藥組收縮壓較單純結(jié)扎組明顯減低,但較假手術(shù)組仍明顯升高,三個用藥組組間血壓無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表2)。3.2各組心肌細(xì)胞橫徑的比較心肌細(xì)胞橫徑(LVTDM)的變化顯示RAC較其它4組心肌細(xì)胞橫徑顯著增大,Ena組、Val組和Aml組組間無差異且顯著高于So組(見圖1和表3)。3.3各組大鼠心肌橫徑的比較圖2縱坐標(biāo)顯示IMDmRNA電泳的條帶與β-action光密度比值測定所得數(shù)值,橫坐標(biāo)顯示不同組別。左心室IMDmRNA在單純結(jié)扎組較對照組和三個藥物干預(yù)組均顯著性升高(P<0.01),三個藥物干預(yù)組之間兩兩比較無差異(P=0.810),三者又均較對照組顯著性升高(P<0.01)(見圖2、表3)。表3說明左心室心肌橫徑在單純不完全結(jié)扎組(RAC)均較其它各組有顯著性增加(P<0.01),Val組、Aml和Ena組組間無差異(P=0.622),且顯著高于So組(P<0.05)。左心室質(zhì)量指數(shù)在單純不完全結(jié)扎組(RAC)均較其它各組有顯著性增加(P<0.01),Val組、Aml和Ena組間無顯著性差異(P=0.263),So組較Val組、Aml和Ena組顯著性降低(P<0.05)。3.4mdmrna泳帶第一列為DNAMarker,其后五列上排為標(biāo)準(zhǔn)β-actin泳帶,下排為左心室肌IMDmRNA泳帶。顯示左心室IMDmRNA在So組較其它組顯著性升高(P<0.01),Val組、Ena組和Aml組均較對照組顯著性升高(P<0.01),Val組、Ena組和Aml組之間無差異(P=0.767),So組的電泳條帶幾乎不顯像(見圖3)。4腎性高血壓大鼠心肌imd的變化IMD是2003年Roh等發(fā)現(xiàn)的一種CGRP家族中的多肽,在血管、左心室甚至在心房、右心室和血清均有低水平的表達(dá),具有降壓、擴(kuò)血管、心臟保護(hù)等作用。已有人用RT-PCR半定量的方法在新生心肌和異丙腎誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中測到了IMDmRNA,而正常心肌細(xì)胞中無表達(dá);又有人持續(xù)、大劑量地給離體自發(fā)性高血壓大鼠(SRH)靜脈注入IMD,可降低平均動脈壓和抑制心肌功能、減輕心肌肥厚,這說明IMD是一個新發(fā)現(xiàn)的對心肌肥厚起代償性保護(hù)機(jī)制的內(nèi)生性因子。袁鷹等發(fā)現(xiàn),SHR心肌和主動脈的IMDmRNA水平上調(diào)。還首次用放射免疫(RIA)法測定發(fā)現(xiàn)IMD在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)時血漿、心肌和主動脈中的含量升高。但是SHR組大鼠組的血漿中的IMD含量和收縮壓呈顯著負(fù)相關(guān),對照組WistarKyoto(WKY)大鼠組則呈顯著正相關(guān)。這說明機(jī)體在正常生理狀態(tài)下,血壓是受血漿IMD水平調(diào)控的,這是一種代償性增高。而在高血壓狀態(tài)下,由于調(diào)節(jié)通路的障礙及機(jī)體的某種器官損傷導(dǎo)致了這種代償性反應(yīng)處于失衡狀態(tài),從而導(dǎo)致了IMD出現(xiàn)了絕對或相對不足,且伴隨著血壓的升高和病理損傷過程的加重,使得這種失代償狀態(tài)更加嚴(yán)重,從而出現(xiàn)了血壓越高,而IMD血漿含量越低的負(fù)相關(guān)。為了解腎性高血壓大鼠IMD的變化規(guī)律,本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用腎動脈結(jié)扎造腎性高血壓模型,用左心室游離壁心肌橫徑和心肌質(zhì)量指數(shù)來衡量左心室肌肥厚,發(fā)現(xiàn)單純結(jié)扎組大鼠心肌橫徑和心肌質(zhì)量指數(shù)較其他組顯著增加,表明腎性高血壓大鼠心肌肥厚模型建立成功。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三種降壓藥物組可以相似地減輕心肌肥厚,左心室IMDmRNA在單純結(jié)扎組較其他組顯著性升高,三個藥物干預(yù)組較單純結(jié)扎組降低且組間無差異,由于選用的三種藥物從不同機(jī)理降壓,其中纈沙坦為ARB(血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑),由于抑制了血管緊張素Ⅱ-1受體(AT-1)反饋性地升高血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ),并降低左心室醛固酮(Aldosterone,ALD)水平;依那普利為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin-convertingenzymeinhibitor,ACEI),抑制了腎素血管緊張素轉(zhuǎn)化酶,使AngⅡ產(chǎn)生減少,也降低左心室ALD水平;氨氯地平作為鈣拮抗劑是擴(kuò)血管劑,對RAAS的影響很小?？梢娦募≈蠭MDmRNA的變化與血壓或左心室肌肥厚有關(guān),而與干預(yù)RAAS的不同環(huán)節(jié)無關(guān),即心肌IMDmRNA的變化獨(dú)立于RAAS的變化。本實(shí)驗(yàn)為首次發(fā)現(xiàn)腎性高血壓大鼠(包括單純結(jié)扎組和藥物干預(yù)組)肥厚心肌中IMDmRNA系統(tǒng)上調(diào),IMD的上調(diào)可能參與了腎性高血壓大鼠左心室肥大的病理生理過程,藥物干預(yù)組纈沙坦、氨氯地平和依那普利都可以使上調(diào)的IMDmRNA部分恢復(fù),由于同時使高血壓和心肌厚度得到相似的改善,即三組比較無差異,所以IMDmRNA的變化是由于三組藥物降低了血壓還是改善了心肌肥厚還不清楚。Bell等也發(fā)現(xiàn)肥厚心肌中IMD上調(diào),且血壓降至正常后恢復(fù)正常。他們給一氧化氮合酶抑制劑誘導(dǎo)的高血壓、心肌缺血大鼠應(yīng)用阿替洛爾或硝苯地平,使血壓降至正常,同時可使NO缺乏的心肌細(xì)胞中上調(diào)的AM、IMD及二者的受體成分恢復(fù)正常,說明壓力負(fù)荷和缺血都參與了刺激心肌肥厚,并誘導(dǎo)了這些相關(guān)調(diào)節(jié)肽及受體的上調(diào)。但另有研究卻有相反的結(jié)論:IMD的作用與心肌壓力超負(fù)荷無關(guān)。Bell和Zhao又在另一個一氧化氮合酶抑制劑誘導(dǎo)的壓力超負(fù)荷模型的左室心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),IMD及其受體成分表達(dá)均明顯上調(diào),應(yīng)用肼屈嗪和或氫氯噻嗪使收縮壓恢復(fù)正常后,但I(xiàn)MD仍然高表達(dá),同時心肌厚度也未恢復(fù)正常,與本研究不同點(diǎn)是利尿劑不能完全逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷模型的左室心肌細(xì)胞的心肌肥厚,并且也不能下調(diào)左室心肌細(xì)胞中IMD,即IMD的上調(diào)不因高血壓降低而恢復(fù)