第7章原核基因表達調控

1第7章原核基因表達調控教學目的：

1.掌握原核基因表達調控的相關概念。

2.掌握乳糖操縱子的結構及調控機理。

3.掌握色氨酸操縱子的結構及調控機理。

4.了解原核基因轉錄后的不同調控方式。教學重點：乳糖操縱子和色氨酸操縱子的調控模型。2第7章原核基因表達調控

7.1原核基因表達調控總論

7.2乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)

7.3色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)

7.4其他操縱子

7.5固氮基因調控

7.6轉錄水平上的其他調控方式

7.7轉錄后調控37.1原核基因表達調控總論所有細胞都有一套準確調節(jié)基因表達和蛋白質合成的機制。自然選擇傾向保留高效率的生命過程。從DNA到蛋白質的過程稱為基因表達，基因表達的實質就是遺傳信息的轉錄和翻譯。對基因表達過程的調節(jié)稱為基因表達調控?；虮磉_調控主要表現在：轉錄水平上的調控和轉錄后水平上的調控。原核生物的營養(yǎng)狀態(tài)和所處的環(huán)境條件對其基因表達具有重要的影響。原核細胞的轉錄和翻譯同時同地發(fā)生。47.1.1原核基因表達調控分類原核基因表達調控主要發(fā)生在轉錄水平上。根據調控機制分為：負轉錄調控和正轉錄調控。原核生物以負調控為主。在負轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產物是阻遏蛋白，起阻止結構基因轉錄的作用。負轉錄調控又可分為負控誘導和負控阻遏。在負控誘導系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應物(誘導物)結合時，結構基因不轉錄。在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應物(誘導物)結合時，結構基因轉錄。阻遏蛋白作用的部位是操縱區(qū)(操縱基因O)。5在正轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產物是激活蛋白。激活蛋白存在時被控制的基因得到表達。正轉錄調控可分為正控誘導和正控阻遏。在正控誘導系統(tǒng)中，效應物(誘導物)的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)。在正控阻遏系統(tǒng)中，效應物的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。轉錄水平上的基因表達調控取決于DNA結構、RNA聚合酶功能、蛋白因子等成分的相互作用。大腸桿菌中參與基因表達調控的蛋白因子是σ因子(見P250表7-2)。677.1.2原核基因表達調控的特點可誘導調節(jié)一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關閉狀態(tài)轉變?yōu)殚_啟狀態(tài)。即在某些物質的誘導下使基因活化。如大腸桿菌的乳糖操縱子屬于誘導型操縱子。誘導型操縱子主要調控分解代謝途徑。可阻遏調節(jié)這類基因平時是開啟的，處在產生蛋白質或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉，阻遏基因的表達。如大腸桿菌色氨酸操縱子屬于阻遏型操縱子。阻遏型操縱子主要調控合成代謝途徑。87.1.3弱化子對基因活性的影響弱化子(衰減子)是一段位于結構基因上游前導區(qū)具有終止子結構的短序列，通過前導序列轉錄產生的mRNA形成類似于終止子的二級結構，達到轉錄終止的目的。弱化子是在研究大腸桿菌的色氨酸操縱子表達弱化現象中發(fā)現的。在這種調節(jié)方式中，起信號作用的是有特殊負載的氨酰-tRNA的濃度，在色氨酸操縱子中就是色氨酰-tRNA的濃度。原核生物利用弱化調控系統(tǒng)建立細致而精細調控機制，以增強對環(huán)境的適應性。97.1.4降解物對基因活性的調節(jié)操縱子學說的核心是使基因從表達抑制狀態(tài)中解脫出來，是從負調節(jié)的角度來考慮基因表達調控的。降解物抑制作用的調節(jié)能使基因由低水平表達變成高水平表達。有葡萄糖時，即使有他的糖，與其相對應的操縱子也不會啟動，不會產生出代謝這些糖的酶來，這種現象稱為葡萄糖效應或稱為降解物抑制作用。葡萄糖能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，使環(huán)腺苷酸受體蛋白(CRP)不能與cAMP形成復合物。降解物抑制作用是通過提高轉錄強度來調節(jié)基因表達的，是一種積極的調節(jié)方式。107.1.5細菌的應急反應細菌在正常情況下，如果環(huán)境中缺少某種能源時能找到其他代用物，進行正常的基因表達調節(jié)。當細碰到菌氨基酸全面匱乏的緊急狀況時，將會產生應急反應，使生產各種RNA、糖、脂肪和蛋白質等幾乎全部的生化反應過程均被停止。實施這一應急反應的信號是ppGpp和pppGpp。產生這兩種物質的誘導物是空載tRNA?？蛰dtRNA會激活焦磷酸轉移酶，使ppGpp大量合成。ppGpp會關閉許多基因，也會打開一些合成氨基酸的基因，以應付這種緊急狀況。ppGpp與pppGpp的作用范圍廣是超級調控因子。117.2乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)1961年，Monod和Jacob提出了操縱子學說，此后不斷完善，1965獲年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。操縱子是基因表達的協(xié)調單位，由啟動基因(P)、操縱基因(O)及其所控制的一組功能上相關的結構基因所組成。操縱基因受調節(jié)基因(I)產物的控制。127.2.1酶的誘導——lac體系受調控的證據在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型大腸桿菌細胞內β-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個細胞內大約只有1~2個酶分子。在培養(yǎng)基中加入乳糖后，酶濃度迅速提高，每個細胞中有超過105個酶分子。當有乳糖供應時，在無葡萄糖培養(yǎng)基中生長的lac+細菌中將同時合成β-半乳糖苷酶和透過酶。培養(yǎng)基中加入乳糖1~2min后，編碼β-半乳糖苷酶和透過酶的lacmRNA量就迅速增加。去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降到幾乎無法檢測到，表明乳糖確實能激發(fā)lacmRNA的合成。137.2.2操縱子模型及其影響因子1961年Jacob和Monod發(fā)表了lac操縱子負控誘導模式，建立乳糖操縱子的控制模型，主要內容如下：Z、Y、A基因的產物由同一條mRNA編碼。該mRNA的啟動區(qū)(P)位于阻遏基因(I)與操縱區(qū)(O)之間，不能單獨起始Z和Y基因的高效表達。操縱區(qū)是DNA上的一小段序列(26bp)，是阻遏蛋白的結合位點。當阻遏蛋白與操縱區(qū)相結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。誘導物通過與阻遏蛋白結合，改變其三維構象而不能與操縱區(qū)相結合，從而激發(fā)lacmRNA的合成。141)Lac操縱子的本底水平表達誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結合，而轉運誘導物需要透過酶，透過酶的合成又需要誘導。有些誘導物不經過透過酶而進入細胞；有些透過酶不經誘導物的誘導而合成。乳糖并不直接與阻遏蛋白結合，真正與阻遏蛋白結合的是異構乳糖(葡萄糖-1,6-半乳糖)。異構乳糖是乳糖在β-半乳糖苷酶催化下形成的。乳糖誘導β-半乳糖苷酶的合成需要有β-半乳糖苷酶的預先存在。在非誘導狀態(tài)下有少量的lacmRNA合成，每個細胞中約有1~5個mRNA分子，這種合成稱為本底水平的組成型合成。152)大腸桿菌對乳糖的反應細菌生長在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，由于lac操縱子本底水平的表達，每個細胞內有幾個分子的β-半乳糖苷酶和透過酶。加入乳糖后，在單個透過酶作用下，少量乳糖進入細胞，再由單個β-半乳糖苷酶轉變成異構乳糖。某個異構乳糖與操縱區(qū)上的阻遏蛋白相結合并使其失活而離開操縱區(qū)，開始lacmRNA的合成。這些mRNA分子翻譯出大量的β-半乳糖苷酶和乳糖透過酶，其結果將導致乳糖大量涌入細胞。16多數乳糖被降解成為葡萄糖和半乳糖。有部分乳糖被轉變成異構乳糖而與阻遏蛋白結合。阻遏蛋白的失活促使mRNA高速合成，進一步提高透過酶和β-半乳糖苷酶的濃度。乳糖降解產生的葡萄糖被細胞用作碳源和能源，降解產生的半乳糖則被另一套酶體系轉變成葡萄糖。如果細胞中所有的乳糖被消耗完，由于阻遏蛋白仍在不斷地被合成，有活性的阻遏蛋白濃度將超過異構乳糖的濃度，使細胞重新建立起阻遏狀態(tài)，導致lacmRNA合成被抑制。173)lacI基因產物及功能lac操縱子阻遏蛋白mRNA是由弱啟動子控制下組成型合成的，每個細胞中有5~10個阻遏物分子。阻遏蛋白由4個相同的亞基組成，每個亞基含有347個氨基酸殘基。每個亞基的N端為DNA結合結構域，中間為與誘導物相結合的兩個相似的核心結構域，C端為α螺旋參與阻遏蛋白的聚合。單體間通過中間核心結構域相互作用形成二聚體，兩個二聚體通過C端α螺旋聚合成四聚體。18無誘導物時，阻遏蛋白通過二聚體的兩個HTH特異性地結合到lac操縱子的操縱基因(O)上，阻止RNA聚合酶與啟動基因(P)結合，抑制lacmRNA的轉錄。當細胞中乳糖水平升高，異構乳糖的濃度增加時，異構乳糖能有效地結合到阻遏蛋白的核心結構域上，引起阻遏蛋白的構象改變。變構后的阻遏蛋白不再特異性地結合lac操縱基因(O)，而隨機地與DNA任意區(qū)域相結合。此時lac操縱子的轉錄起始區(qū)暴露，被RNA聚合酶結合，激活lacmRNA的轉錄。乳糖耗盡后，阻遏蛋白重新與操縱基因(O)結合，終止轉錄。19204)葡萄糖對lac操縱子的影響β-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把乳糖分解成葡萄糖及半乳糖。半乳糖在gal操縱子的作用下再轉化成葡萄糖。將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā)lac操縱子。葡萄糖對lac操縱子表達的抑制是間接的。一個大腸桿菌突變體，它在糖酵解途徑中不能將葡萄糖-6-磷酸轉化為下一步代謝中間物，這些細菌的lac基因能在葡萄糖存在時被誘導合成。這說明是葡萄糖的某些降解產物抑制了lacmRNA的合成，將葡萄糖的這種效應稱為代謝物阻遏效應。215)cAMP與代謝物激活蛋白(CAP)大腸桿菌中，cAMP的濃度受葡萄糖代謝的調節(jié)。大腸桿菌在缺乏碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞內cAMP濃度就高；在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，cAMP的濃度就低。培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度也會很高。糖酵解途徑中位于葡萄糖-6-磷酸與甘油之間的某些代謝產物是腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制劑。代謝物激活蛋白(CAP)，又稱為環(huán)腺苷酸受體蛋白(CRP)，由Crp基因編碼，能與cAMP形成復合物。ACP(CRP)和cAMP是合成lacmRNA所必需的。22CRP蛋白為二聚體，每個CRP結合一個cAMP。CRP與cAMP形成復合物后才能結合到CAP位點。CAP位點位于-60bp處，鄰近啟動基因(P)。CAP結合位點的DNA序列有2個保守的5個堿基序列TGTGA。RNA聚合酶的α亞基的C端結構域(αCTD)與ACP位點附近的DNA序列結合。通過與αCTD的相互作用，cAMP-CRP復合物幫助RNA聚合酶結合到啟動基因上，激活lacmRNA的轉錄。cAMP-CRP復合物是激活lac操縱子的組成部分。cAMP-CRP是不同于阻遏蛋白的正調控因子。lac操縱子受控于這兩個相互獨立的調控體系。23cAMP-CRP復合物結合于啟動子上游，能使DNA雙螺旋發(fā)生彎曲，有利于形成穩(wěn)定的開放型啟動子-RNA聚合酶結構。阻遏蛋白則是一個抗解鏈蛋白，阻止形成開放結構，而抑制RNA聚合酶的功能。lac操縱子正負調控的協(xié)調作用：負調控——受乳糖和阻遏蛋白調節(jié)正調控——受cAMP和CAP調節(jié)兩種調控機制根據存在的C源性質和水平協(xié)同調節(jié)lac操縱子的表達。24257.2.3lac操縱子DNA的調控區(qū)——P、O區(qū)從已分離得到含有l(wèi)ac操縱子的DNA片段中發(fā)現，P區(qū)(即啟動子區(qū))一般是從I基因結束到mRNA轉錄起始位點下游5-10bp。而O區(qū)(即阻遏物結合區(qū))位于-7~+28位，該區(qū)的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對。實驗表明，阻遏蛋白與O區(qū)的結合影響了RNA聚合酶與啟動區(qū)結合形成轉錄起始復合物的效率。267.2.4lac操縱子中的其他問題lac操縱子中的lacA基因編碼β-半乳糖苷乙?；D移酶，其作用是將乙酰輔酶A上的乙?；D移到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。自然界中存在著許多種能被β-半乳糖苷酶降解的半乳糖苷分子，它們的分解產物往往不能被進一步代謝，很容易在體內積累。半乳糖苷衍生物在高濃度時是細胞正常生長的抑制物。半乳糖苷乙?；?，即無毒。lacA基因產物雖然不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物質的積累。1)lacA基因及其生理功能272)lac基因產物數量上的比較在一個完全被誘導的細胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D移酶的拷貝數比例為1:0.5:0.2。這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為惟一碳源時細胞的需要。不同的酶在數量上的差異是由于在翻譯水平上受到調節(jié)所致。這種調節(jié)有以下兩種方式：lacmRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質鏈的翻譯。在lacmRNA內部，A基因比Z基因更易受內切酶作用發(fā)生降解，在任何時候Z基因的完整拷貝數要比A基因多。283)操縱子的融合與基因工程操縱子在自然條件下可能發(fā)生融合。如lac操縱子與負責嘌呤合成的pur操縱子的偶聯。pur操縱子位于lac操縱子的下游，中間只間隔了一個控制細胞對T6噬菌體敏感的tsx基因。tsxRZ-突變體：POZYAtsxPOpur結構基因缺失在這個體系中，pur操縱子被連接到lac操縱子的啟動基因上，形成融合基因。用強啟動子可使具弱啟動子的轉錄增強而增加蛋白質的合成量。基因融合在基因工程中被廣泛應用。297.3色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)色氨酸操縱子負責色氨酸的生物合成，培養(yǎng)基中有足夠的色氨酸操縱子關閉，缺乏時被打開。trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調控。色氨酸的合成分5步完成，每個環(huán)節(jié)需要一種酶。編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉錄在一條mRNA上，分別以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，編碼鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉移酶、鄰氨基苯甲酸異構酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。30317.3.1色氨酸操縱子的結構調節(jié)基因(trpR)與結構基因不緊密連鎖。操縱基因在啟動子內。啟動子和結構基因不直接相連，被前導序列(trpL)所隔開。前導序列編碼前導肽和弱化子(衰減子)。trpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA結構基因操縱基因trpL:編碼前導序列編碼前導肽衰減子trpR327.3.2色氨酸操縱子可阻遏的負調控trpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA啟動子操縱基因trpR脫輔基阻遏蛋白單體二聚體Trp是輔阻遏物

低濃度Trp或缺乏Trp時，脫輔基阻遏蛋白沒有活性，不能與操縱基因結合，結構基因轉錄。mRNA33trpR啟動子trpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA操縱基因二聚體

高濃度Trp時，Trp與脫輔基阻遏蛋白結合，使其具有結合操縱基因的構象，阻遏結構基因轉錄。脫輔基阻遏蛋白單體trp阻遏蛋白二聚體阻遏基因轉錄34trpRtrpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA脫輔基阻遏蛋白單體mRNAtrp分枝酸二聚體阻遏蛋白二聚體阻遏基因轉錄357.3.3弱化子與前導肽弱化子又稱衰減子是DNA中可導致轉錄過早終止的一段核苷酸序列。在trpmRNA5'端trpE基因的起始密碼前有一個長162bp的mRNA片段被稱為前導區(qū)。當mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉錄總是在這個區(qū)域終止，產生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉錄。轉錄終止發(fā)生在這一區(qū)域，并且這種終止是被調節(jié)的，這個區(qū)域就被稱為弱化子。1)弱化子362)前導肽及前導mRNA序列衰減作用需要負載tRNATrp參與，這說明前導序列的某些部分被翻譯了。前導序列中包括起始密碼AUG和終止密碼UG