第四節(jié) 人類基因組計劃

第三節(jié)人類基因組計劃一、人類基因組計劃介紹二、序列圖以前計劃三、測序與序列圖四、后基因組安徽大學生命科學學院查向東根據(jù)原書及其它資料制作一、人類基因組計劃介紹人類基因組計劃的產(chǎn)生與“腫瘤計劃”的擱淺是分不開的。美國從70年代起啟動了“腫瘤計劃”，結果令人失望。人們漸漸認識到，包括癌癥等人類疾病與基因直接或間接相關,測出基因序列，則是研究基因的基礎。這時，科學家們面臨兩種選擇：要么“零敲碎打”地從人類基因組中分離和研究出幾個腫瘤基因，要么對人類基因組進行全測序。1986年3月，杜伯克在美國《科學》雜志上發(fā)表了《癌癥研究的轉折點：測序人類基因組》的文章，后來被稱為人類基因組計劃的“標書”。杜伯克說，正確的選擇是對人類基因組(30億個堿基對)進行全測序。

人類基因組計劃進程

1984年12月，美國猶他大學的魏特受美國能源部的委托，主持討論了DNA重組技術及測定人類整個基因組DNA序列的意義。1985年6月，美國能源部提出“人類基因組計劃”的初步草案。1986年6月，在新墨西哥州討論了人類基因組計劃的可行性，隨后美國能源部宣布這個草案。在紐約冷泉港討論會上，諾貝爾獎金獲得者吉爾伯特以及伯格主持了“人類基因組計劃”的專家會議。1987年初，美國能源部與國家醫(yī)學研究院為人類基因組計劃下?lián)芰藛咏?jīng)費550萬美元。1987年總額年1．66億美元。美國開始籌建“人類基因組計劃”實驗室。1989年，美國成立“國家人類基因組研究中心’，諾貝爾獎金得主、DNA分子雙螺旋結構模型的提出者詹姆斯·沃森擔任第一任主任。1990年，美國國會批準美國的“人類基因組計劃”在10月1日正式啟動。其總體規(guī)劃是準備在15年內(nèi)至少投入30億美元，進行對人類的基因組分析。

世界其他國家也開始了基因測序工作中國的人類基因組計劃于1993年開始，成為國家自然科學基金委員會、國家高技術計劃、和國家重點基礎研究計劃共同資助的“重大項目”。由著名遺傳學家組成了這個項目的顧問委員會，由中青年科學家組成學術專家委員會；還有一個“中國人基因多樣性委員會”和“社會、法律、倫理委員會”，另有一個秘書處負責國際聯(lián)絡、國內(nèi)協(xié)調(diào)與日常事務。二、序列圖以前計劃

30億個堿基對是一個很長的序列，搞清這個長序列需要其他輔助工作配合。“人類基因組計劃”分為兩個階段：DNA序列圖以前計劃和DNA序列圖計劃。

序列圖以前計劃包括物理圖、遺傳圖。（一）、遺傳圖不同基因或序列在染色體上的分布與排列，稱連鎖圖。作圖方法:

1.二點或三點測驗

2.系譜分析

3.細胞融合與輻射

4.DNA標記作遺傳圖

物理圖有兩個要素：一是序列，二是位置。物理圖就像路標。（二）、物理圖所謂“物理圖”是以特定的DNA序列為標記，利用酶切位點或分子雜交的方法確定這些特定的DNA標記在基因組或DNA上的相對位置的排列圖，以DNA的實際長度(Mb、Kb或bp)為它們之間的圖距。

1.限制酶切位點作圖

限制酶切位點作圖是以DNA分子上特定位置的限制性酶切位點的相對位置作圖。2.熒光原位分子雜交(FISH技術)

熒光原位分子雜交是將分子標記(也叫探針)和完整的染色體上的DNA分子互補雜交來確定標記的位置。進行原位雜交時，先將染色體貼在載玻片上，加溫使雙鏈DNA螺旋變性成為單鏈分子,隨后加入熒光探針并降溫，使DNA復性，帶熒光的探針和染色體上的DNA同源部分互補雜交，用熒光顯微鏡觀察信號，定位序列的位置。早年的FISH技術僅用于細胞分裂中期的染色體的定位，由于染色體是高度濃縮的，兩個熒光標記至少距離在1Mb以上才能被分開，因此用此法不足以構建有效的物理圖。近年來，一系列使DNA伸展和梳理的技術使FISH分辨率大大提高，達到可用于染色體物理作圖的目的。3.序列標簽位點（SequenceTagSite，STS）標記是根據(jù)單拷貝的DNA片段兩端的序列，設計一對特異引物，擴增基因組DNA而產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列。STS標記采用常規(guī)PCR所用的引物長度，因此PCR分析結果穩(wěn)定可靠。RFLP標記經(jīng)兩端測序，可轉化為STS標記。實際上，任何一個惟一的DNA序列均可作為STS.一個DNA序列要成為STS，須滿足兩個前提。首先它的序列必須是己知的，以便于用PCR方法檢測STS在不同DNA片段中存在與否。第二個要求是STS必須在待研究的染色體上有唯一的定位.

4.表達序列標記表達序列標記簡稱EST，是通過cDNA克隆分析而得到的短序列.EST可以是一個完整基因的一個片段。只有當EST在基因組中是單一序列而不是一個家族成員的DNA時．它才可以作為一種STS。

1996年10月，Homosapiens的一個全基因組轉錄圖發(fā)表于Science上（Schuleretal.,1996）。這個圖由～15000個不同的表達序列組成，由放射性雜交法定位。1998年確定了人類基因組20104個EST，并將其定位于16354個不同位點上，平均作圖密度達到每183kb一個標記，占到總物理圖標記的1/3，大大提高了物理圖的分辨率。利用EST作為標記所構建的分子遺傳圖譜被稱為轉錄圖譜。（三）、克隆文庫由于基因組太大，為了減少文庫的克隆救量，科學家通常先構建大片段DNA克隆和連續(xù)克隆系，如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)和噬菌體人工染色體(PAC)等，在這些大片段克隆的基礎上再構建亞克隆系，為測序提供大小合適的片段。以大腸桿菌進行DNA克隆實驗為例:第一步，DNA用限制酶消化或超聲波等方法處理；第二步，用限制酶消化克隆體．該酶在環(huán)狀載體上只Y有一個酶切位點；第三步，連接產(chǎn)生重組DNA分子。個別染色體的分離

有時為了方便或工作上的分工，一批科學家可以先集中做一條染色體工作，建立覆蓋一條染色體的特異克隆文庫。這需要利用流式細胞儀，這種儀器可以幫助分離單個染色體。操作時先小心地從含有凝縮染色體的細胞中獲得一套完整的染色體，然后用熒光染料對染色體染色，因為結合染料的分量依賴于染色體的長度，較大的染色體結合的染料較多，因此熒光強度比短染色體強。加上稀釋液后，染色體通過小孔以形成液滴流，每一個液滴只含一根染色體，當液滴通過監(jiān)測儀器時，就可以根據(jù)熒光強度判斷所含的染色體，再經(jīng)過電腦操作，在含所需要染色體的液滴上加上電荷，當它通過電場時將它與其他液滴分開。如果兩個不同的染色體長短相近，如人類的第2l號和22號染色體，大小非常接近，這時可根據(jù)它們所含的堿基AT和GC的豐富程度不同來加以區(qū)分。對應AT和GC豐富區(qū)的高親和染料分別是Hoechst33258和染色素A3,因此可根據(jù)它們結合特異性染料的量的多少將它們區(qū)別開來。

三、測序與序列圖（一）、測序方法因為—個反應只能測得幾百個核苷酸序列，對于高等生物基因組來說，這不過是幾十萬分之一的序列長度。在此基礎上，科學家又作了—個重要的改進，用一組毛細管電泳來替代聚丙烯酰胺凝膠電泳，在以上熒光自動化檢測過程中．我們已經(jīng)看到4種帶熒光的ddN可以合并在一條泳道中進行。那么，把泳道細化成毛細管，一組毛細管電泳儀有96道，一次可同時完成96個片段的測序，一天就能測1000個左右的片段。（二）、DNA序列的連續(xù)組裝

我們的目的是要完成由幾千萬到幾億核苷酸組成的一條染色體全序列，甚至是全基因組序列，這就要求解決如何將這些短序列拼接起來這一問題。目前，常有三種方法用于基因組的研究。這些是：鳥槍法、克隆疊連群法與指定鳥槍法。目前主要應用的是后兩種。

流感嗜血桿菌DNA用超聲波打斷，長1.6～2.0kb的片段從瓊脂糖凝膠純化，連入質粒載體建成克隆文庫。文庫中的克隆測序后得到末端序列，用計算機找出序列間的重疊區(qū)。共得到140個序列重疊群，由此拼按出完整的基因組序列。2001年2月，國際人類基因組測序聯(lián)合體和美國Celera公司聯(lián)合公布了人類基因組序列工作草圖和初步分析結果。

人類基因組序列圖是向全世界開放的，是全人類的一份財富，所有感興趣的個人和團體都可以通過其網(wǎng)站(/genome/seg/)獲取你所要知道的信息，深入研究基因組科學。除了人類基因組外，其他物種的基因計算也先后啟動。已完成大約800種生物的全基因組測序。如大腸桿菌、酵母、線蟲、擬南芥（5條染色體近120Mb的測序，發(fā)現(xiàn)該基因組編碼25000個以上基因）。2000年美國兩家農(nóng)業(yè)生物技術公司宣布了水稻(粳稻日本晴)基因組框架圖，中國科學院及北京華大基因組2001年10月完成了粳稻93?11基因組框架圖，發(fā)現(xiàn)水稻可能編碼5萬多個基因。２００３年，我國科學家在國際上率先獨立完成鉤端螺旋體、表皮葡萄球菌、野油菜黃單胞菌三種重要人類和植物病原體的全基因組精細測序，同時還在國際上首次識別出了與它們生命活動密切相關的整套基因，并發(fā)現(xiàn)了一批與致病性相關的功能基因，鑒定出了一批可望用于發(fā)展新一代疫苗的靶標基因。微生物基因組學在談到微生物基因組學研究未來的發(fā)展方向時，趙國屏表示，后基因組時代的一項重要工作便是功能基因組學研究，它是利用結構基因組提供的海量生物學信息，通過發(fā)展和應用新的實驗手段，在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使生物學研究從對單一基因或蛋白質研究轉向對多個基因或蛋白質同時進行系統(tǒng)的研究，是在堿基序列-基因組靜態(tài)-完成后轉入對生物學功能-基因組動態(tài)-的研究。測序是重要的，不應該不重視測序，但同時又不能只看重測序，關鍵是在做完微生物測序以后，如何利用測序所得到的結果和數(shù)據(jù)進行功能研究，找到有意義的科學發(fā)現(xiàn)，并使之投入到實際應用中去，這需要科學家靜下心來，踏踏實實地搞好研究工作。四、后基因組時代ThePost-GenomicEraFunctionalgenomics，又稱為后基因組Postgenomics研究基因組中各基因的功能，包括基因的表達及其調(diào)控模式的學科。利用結構基因組學研究所得的各種信息在基因組水平上研究編碼序列及非編碼序列生物學功能的學科。（一）、搜尋DNA序列中的基因

獲得DNA序列后，無論是一些DNA片段或是整個染色體，都可以通過多種途徑從中找出和定位基因，也可以由計算機根據(jù)序列的特征對DNA進行篩查。1、尋找閱讀框

2、篩查同源性序列

由于多年的積累，許多不同物種的基因已經(jīng)被成功克隆和測序，利用這些已知的序列，可以對基因組或一段DNA進行同源性檢索，區(qū)分它是基因還是隨機序列，彌補高等真核生物基因組中閱讀框搜尋的不足。同源序列的篩查還有利于發(fā)現(xiàn)代表生物進化上的相關基因，并且研究基因的功能。（1）Norther雜交法既然表達序列一定會轉錄成RNA，那就可以用分子雜交辦法來測定。RNA分子用凝膠電泳分離，用Northern印跡法將RNA轉到膜上，然后用標記的DNA片段進行Northern印跡，出現(xiàn)條帶的，就可以證明此片段表達RNA?；虻谋磉_，因細胞種類、發(fā)育時期的不同而異，所以某種細胞是否轉錄某種RNA，以及含量多少是有明顯區(qū)別的，分析時必須考慮到這些情況。3.確認基因搜尋到基因之后，一般還需要確認基因。具體方法是兩種分子雜交法。

（2）動物園雜交法鑒于細胞是否轉錄某種RNA受組織特異性表達和發(fā)育時間的影響，因此有人發(fā)明用其他生物中相關的DNA序列替代本生物體RNA來進行分子雜交。相關生物種的同源基因有相似的編碼序列，而非編碼序列則差別較大。將一個物種的DNA片段用于相關物種DNA的分子雜交檢測，且有一個或多個雜交信號，用此探針就可能確認一個或多個基因，這種方法被稱為動物園雜交法(Zooblotting)。種屬間印跡的目的是判斷人DNA片段能否與相關種屬的DNA雜交。制備人、黑猩猩、牛和兔的DNA，用限制酶酶切，然后進行瓊脂糖電泳，最后以人DNA片段為探針進行Southern雜交。每個動物DNA中都可見一陽性信息，說明此人DNA片段含有一表達的基因。注意牛和兔的雜交片段要比人和黑猩猩的小。這表明在牛和兔中表達順序周圍的限制圖譜是不同的，但這并不影響得出四個種屬中存在同源基因的結論。（二）基因功能的研究

這是基因研究中既重要又艱巨的工作之一。由于許多物種的基因組測序工作已經(jīng)完成，找到可能是基因的序列比以前上百年來依靠突變分析要快得多。例如大腸桿菌編碼蛋白的基因，現(xiàn)認為是4288個，而以往幾十年通過突變鑒定僅測得1853個，只占總數(shù)的43%，新發(fā)現(xiàn)的基因占57％，這些新發(fā)現(xiàn)的基因就需要先作功能預測，再進一步確定其功能。而酵母還有70％的基因的功能需要預測和確定。這兩個被人們研究得比較透徹的模式生物，還有那么多的基因等待研究，其他生物，特別是高等生物有待研究的基因的比例就更大了。

1．計算機同源比較預測功能

同源比較不僅是計算機發(fā)現(xiàn)新基因的重要手段，也是預測基因功能的重要依據(jù)。同源基因來自于共同祖先，基因序列相似，根據(jù)出現(xiàn)種屬分化的前后又可以分為正同源(種間同源)和副同源(種內(nèi)同源)兩種，前者同源基因存在于不同物種中，說明它們的共同祖先出現(xiàn)于種屬分化之前；而后者是指同一物種生物內(nèi)部的同源基因，常是多基因家族的成員，它們的共同祖先可能是早于，也可能是晚于種屬分化。通常，一對同源基因并不完全相同，只能說是很相似，因為在長期進化過程中，它們各自隨機突變積累了差異。如果新測序的基因和另一個原來已測序的基因序列相似，那么新基因有可能和原來基因有相同或相似的功能。2．實驗分析法確定基因的功能經(jīng)典遺傳學的思路從表型入手，通過突變體來確定相關基因，而基因組測序和基因搜尋之后，是采用一個相反的策略，