木素降解酶在紙漿中的生物技術(shù)漂浮

木素降解酶在紙漿中的生物技術(shù)漂浮

隨著人類環(huán)保和生態(tài)意識(shí)的增強(qiáng)，環(huán)境對(duì)有害、致殘和異常的有機(jī)氯化物，尤其是具有有機(jī)二氯酯氣味的化合物的限制越來越嚴(yán)格。在國(guó)際范圍內(nèi),對(duì)無元素氯和全無氯漂白的研究迅速展開。生物技術(shù)漂白將成為上述兩種漂白的重點(diǎn)研究對(duì)象。利用微生物或其分泌的酶與紙漿作用,達(dá)到脫木素或有利于脫木素,并提高紙漿白度或改善紙漿可漂性的過程稱為生物漂白。然而,直接用活體微生物處理原料或紙漿存在作用周期長(zhǎng)、易生長(zhǎng)雜菌等問題,不利于進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。近年來,直接用木素降解酶,包括木素過氧化物酶(Ligninperoxidase)、錳過氧化物酶(Manganesedependentperoxidase)和漆酶(laccase),對(duì)紙漿進(jìn)行漂白。隨后,通過高產(chǎn)菌株的大規(guī)模發(fā)酵便可獲得大量的漆酶,如真菌pycnoporuscinnabrinus發(fā)酵產(chǎn)漆酶,Lomascolo等利用菌株高產(chǎn)漆酶,使漆酶成為上述3種木素降解酶中最具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的酶。漆酶是通過催化單電子氧化被取代的苯酚、苯胺和芳香硫醇等低氧化還原電勢(shì)的化合物成它們所對(duì)應(yīng)的自由基,并伴隨將氧氣還原成水的一類含多種銅離子的氧化酶。與具有大于1V氧化還原電勢(shì)的木素過氧化物酶相比,低氧化還原電勢(shì)(0.5～0.8V)的漆酶僅能直接氧化降解具低氧化還原電勢(shì)的酚型木素結(jié)構(gòu)單元。而占木素總量中絕大部分的非酚型木素結(jié)構(gòu)單元?jiǎng)t不能被氧化。Bourbonnais等和Call等發(fā)現(xiàn)了對(duì)漆酶漂白起到較好催化效率的人工合成介體,使漆酶可以氧化非酚型木素等本身不能直接被氧化的底物。但是,由于這些人工合成的介體市場(chǎng)價(jià)格昂貴及難確保其本身或其衍生物不具有毒性等缺陷,漆酶-介體體系仍未應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),僅由Call在1994年進(jìn)行中試試驗(yàn)。應(yīng)用白腐菌氧化木素所產(chǎn)生的衍生物或微生物的代謝產(chǎn)物作為漆酶漂白的天然介體,具有環(huán)境和生態(tài)的優(yōu)勢(shì)。Camarero等發(fā)現(xiàn),桉木硫酸鹽漿黑液中含有的部分小分子酚類化合物具有與HBT(1-羥基苯并三唑)相當(dāng)?shù)拇呋崦傅幕钚浴１疚木C述了應(yīng)用于漆酶漂白介體的最新研究進(jìn)展,包括從黑液中分離和鑒定天然的漆酶介體,并將之與人工合成介體催化漆酶對(duì)染料的脫色、去除親脂性抽出物的能力及對(duì)紙漿漂白的潛能進(jìn)行比較。1漆酶介質(zhì)體系中酶ca件的科學(xué)研究1.1電子受體的形成介體及漆酶的底物反應(yīng)式可表述為:2底物—H2+O2?→漆酶?介體2Η2+Ο2→漆酶-介體2底物(ox)+2H2O即漆酶首先從氧化還原電勢(shì)低的介體中獲得電子,將介體氧化;介體便成為氧化還原電勢(shì)較高、穩(wěn)定的中間體,而此時(shí)的酶便以另一中間體的形式存在。之后,酶形成的中間體又將電子傳遞給氧氣,氧獲得電子和氫質(zhì)子后便轉(zhuǎn)化為水,成為最終的電子受體。漆酶形成的中間體失去電子后便重新恢復(fù)活性。而被氧化形成具有高氧化還原電勢(shì)的介體自由基則進(jìn)攻木素單元,從木素中獲得電子,使木素氧化降解。而介體形成的中間體在獲得電子后也重新回到其最原始的狀態(tài)。這樣的過程構(gòu)成了一個(gè)催化的氧化還原循環(huán)體系,其假設(shè)的反應(yīng)步驟見圖1。1.2非酚型木素的合成及應(yīng)用由于小分子介體克服了漆酶應(yīng)用于漂白所具有的低氧化還原電勢(shì)和蛋白質(zhì)大分子進(jìn)攻木素所形成較大空間位阻的障礙,目前的研究主要集中在探明LMS(Laccse-Mediator-System)氧化非酚型木素的機(jī)制;尋找穩(wěn)定、高效、低毒和價(jià)廉的新介體,并將這些介體應(yīng)用于催化漆酶的生物漂白。然而,介體的發(fā)現(xiàn)到廣泛應(yīng)用是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程,從人們猜想其天然介體的存在,到人工合成,再到從黑液中尋找生態(tài)和環(huán)境友好型的天然介體。其發(fā)展階段見表1。2有機(jī)物主要被其降解原料成分中除了纖維素、半纖維素外,占主要部分的便是木素?；瘜W(xué)法制漿將大量木素氧化降解并轉(zhuǎn)移到黑液中,而包括木素在內(nèi)的所有有機(jī)物又在黑液堿回收過程中轉(zhuǎn)化為熱能。但被降解的部分木素小分子仍然有可能吸附于漿料上,將增加后續(xù)漂白的化學(xué)品用量。如果能有效的分離這些小分子,并將其轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品,既可充分利用生物質(zhì)資源,又可降低化學(xué)品消耗。進(jìn)一步說,從黑液中分離小分子酚類化合物作為漆酶漂白的天然介體,不僅有效的利用了黑液,也有利于促進(jìn)LMS生物漂白的工業(yè)化進(jìn)程。2.1有機(jī)相的制備事實(shí)上,丁香醛和乙酰丁香酮等具有較高漆酶催化效率的介體,不僅是白腐菌等微生物或漆酶的主要降解產(chǎn)物,也是化學(xué)品(主要是堿)對(duì)富含丁香基型木素降解的主要產(chǎn)物。所以,下面僅介紹從桉木硫酸鹽漿黑液和非木材堿法漿黑液中分離小分子酚類化合物的方法。從桉木硫酸鹽漿黑液中分離小分子酚類物質(zhì):方法1:黑液→蒸餾水,體積比1∶1稀釋→質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的H2SO4調(diào)pH值為2→離心,取液體→用體積比為1∶1的乙醚萃取24h,取有機(jī)相→用體積比1∶1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%NaHCO3萃取24h,取有機(jī)相→加體積比1∶1NaOH萃取,取水相→質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%鹽酸調(diào)pH值為2→乙醚萃取,取有機(jī)相→蒸發(fā)濃縮→小分子酚類物質(zhì)。方法2:黑液→蒸餾水,體積比1∶1稀釋→質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的H2SO4調(diào)pH值為2→過濾,濾渣干燥后用適量乙醚萃取,收集有機(jī)相;濾液用體積比1∶1乙醚萃取,收集有機(jī)相→水相用體積比1∶1的乙酸乙酯萃取,收集有機(jī)相→混合3種有機(jī)相,蒸發(fā)濃縮→小分子酚類物質(zhì)。從蔗渣堿法漿黑液中分離小分子酚類物質(zhì):方法3:黑液→過濾→加稀鹽酸調(diào)pH值到9～9.5,懸浮液用體積比1∶1的乙醚萃取14天→收集有機(jī)相,水相用體積比1∶1的CHCl3萃取14天,收集有機(jī)相→混合有機(jī)相,加MgSO4干燥,蒸發(fā)濃縮小分子酚類物質(zhì)。2.2基本組分測(cè)定將從桉木硫酸鹽漿黑液中分離的小分子酚類物質(zhì)進(jìn)行GC-MS分析,見圖2,其物質(zhì)鑒定如表2。另外兩種分離方法所得主要組分與方法1基本相同。從圖2可以看出,此組分中丁香醇、丁香醛、丁香酮和丁香樹脂占絕大部分。Camarero等利用購(gòu)買的丁香醛、乙酰丁香酮等和HBT作為漆酶的介體對(duì)紙漿進(jìn)行漂白,證明丁香醛、乙酰丁香酮具有與HBT稍差的酶催化功效,而其用量?jī)H為HBT的50%,說明從黑液中分離小分子酚類物質(zhì)作為漆酶漂白的介體是可行的。3利用不同的天然介體對(duì)酸性藍(lán)773號(hào)脫色效果的影響自1994年,Call等用LEQP(L,木素酶漂白;E,堿抽提;Q,螯合處理;P,過氧化氫漂白)和LELEQP兩種新的漂序代替工業(yè)上原有的OZEP(O,氧脫木素;Z,臭氧漂白)漂白流程,對(duì)兩種不同的漿料進(jìn)行中試試驗(yàn),并取得單段脫木素率可大于50%、介體用量可縮減至0.6%的效果。LMS生物漂白便迅速成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。然而,由于催化效率較高的HBT等人工介體本身具有成本高和毒性等不利因素,到目前為止,包含LMS在內(nèi)的TCF漂白流程仍未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。近期,已有文獻(xiàn)介紹用木素小分子酚類衍生物作為L(zhǎng)MS中酶催化的天然介體,應(yīng)用于染料的脫色、去除紙漿中親脂類抽出物和紙漿的漂白等方面,并取得較好的效果。Camarero等首次用木素小分子酚類衍生物作為漆酶的天然介體,對(duì)不同染料進(jìn)行脫色。圖3為相同條件下,漆酶-天然介體體系和漆酶-人工介體體系對(duì)酸性藍(lán)74號(hào)脫色效果的比較。實(shí)驗(yàn)表明,兩種紫丁香基型木素衍生物(丁香醛和丁香酮)被漆酶氧化的速率比愈創(chuàng)木酚型木素衍生物快50～100倍。同時(shí),也是包括人工介體在內(nèi)的所有介體中催化效率最快,脫色效果最好的漆酶介體。但相比之下,沒有介體存在時(shí),漆酶基本沒有脫色能力。因?yàn)榈脱趸€原潛能的漆酶根本不能氧化具高氧化還原電勢(shì)的染料。Ana等用漆酶-天然介體體系與桉木硫酸鹽未漂漿作用,接著進(jìn)行H2O2漂白,僅谷甾醇和豆甾烷醇沒有完全處理掉。而未經(jīng)漆酶-介體體系處理或用HBT作為漆酶介體進(jìn)行處理后的紙漿抽出物中仍然有大量的親脂性物質(zhì)存在。結(jié)果見圖4。從圖4A中可知,僅僅用H2O2處理紙漿,大量甾醇類親脂性物質(zhì)無法除去;從圖4B中可知,利用漆酶-HBT體系進(jìn)行處理,然后再用H2O2處理,甾族碳水化合物基本被除去,豆甾醇和豆甾烷醇含量大大減少,谷甾醇酯和谷甾醇-3β-D-吡喃葡萄糖苷都被除去;從圖4C中可知,雖然豆甾醇和豆甾烷醇沒有被完全除去,但漿料中二者的含量大大減少,其他親脂類物質(zhì)都被除去。最近,Camarero等利用從P.cinnabarinus中獲得并經(jīng)純化的漆酶,在木素小分子酚類衍生物作為天然介體及氧氣存在的條件下,對(duì)桉木硫酸鹽漿進(jìn)行漂白,卡伯值由14降至10左右,白度由41%增至67%左右,結(jié)果見圖5。上述實(shí)驗(yàn)表明,LMS在合適的天然介體存在下,有顯著的脫木素和提高紙漿白度的作用。雖然丁香醛和丁香酮的催化效果比HBT稍差,但具有價(jià)廉、用量少和無毒等經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的特性,使LMS生物漂白更有潛在的應(yīng)用前景。4非酚型木素類衍生物隨著真菌漆酶的可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)及HBT等高效催化介體的出現(xiàn),特別是Call進(jìn)行LMS生物漂白的中試試驗(yàn),解決了