利用反向遺傳學(xué)方法敲除細(xì)胞基因

利用反向遺傳學(xué)方法敲除細(xì)胞基因

絲蟲菌占真菌世界的很大一部分，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)生物學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。一些重要的工業(yè)菌株用于生產(chǎn)酶、有機(jī)酸等物質(zhì),如黑曲霉、綠色木霉等。一些與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著重要的關(guān)系,既是重要農(nóng)作物上的病原菌,如稻瘟病菌、棉花黃萎病菌等;又是生防真菌,具有防治植物病蟲害的功能,如綠僵菌、木霉菌等。另一些絲狀真菌在醫(yī)藥上有著舉足輕重的作用,如來源于海洋的絲狀真菌、一種新型的可以產(chǎn)生抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散物質(zhì)的灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)。同時,由于絲狀真菌中的構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)和粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)基因組相對簡單、可操作性強(qiáng),可作為“模式”種用于真核生物的一些生物學(xué)特性研究。隨著大量絲狀真菌基因組序列的測定以及高效分子研究手段的發(fā)展,以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)已經(jīng)成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。目前已有一些方法用于絲狀真菌基因功能的研究,如轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、基因敲除技術(shù)、RNA干擾、超表達(dá)及酵母雜交系統(tǒng)等。其中基因敲除技術(shù)能夠有效和特異性地抑制目標(biāo)基因的表達(dá),操作簡單易行,是構(gòu)建許多真菌基因突變體的首選技術(shù),故應(yīng)用十分廣泛。1995年P(guān)aulBundock首次應(yīng)用農(nóng)桿菌實現(xiàn)了對釀酒酵母的轉(zhuǎn)化,1998年deGroot等構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系。該方法操作簡單、受體范圍廣、轉(zhuǎn)化效率高、單拷貝率高及突變體遺傳穩(wěn)定,解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法的瓶頸。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法已是目前實現(xiàn)真菌遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛的方法之一。利用該方法成功轉(zhuǎn)化的真菌已有100種,而且已有多種真菌利用該方法構(gòu)建了含豐富類型轉(zhuǎn)化子的突變體庫,通過突變體表型來篩選特定的基因。另外,隨著真菌基因組測序的完成,使得ATMT結(jié)合反向遺傳學(xué)的方法定向分析基因的功能成為了可能。1基因打靶技術(shù)基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種研究基因功能的新型技術(shù)。此后經(jīng)歷了將近20年的推廣和應(yīng)用,直到2007年10月8日,美國科學(xué)家Capecchi和OliverSmithies、英國科學(xué)家Evans因為在利用胚胎干細(xì)胞對小鼠基因進(jìn)行定向修飾原理方面的系列發(fā)現(xiàn)分享了2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎,基因打靶技術(shù)才獲得諾貝爾獎評審委員會的關(guān)注和肯定。早在1973年,Mishra等首次報道了絲狀真菌粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)的DNA轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,他們用野生型菌株的總DNA處理肌醇缺陷型菌株,獲得了肌醇原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化菌株,但受到質(zhì)疑;因為在當(dāng)時普遍認(rèn)為真核生物發(fā)生轉(zhuǎn)化幾乎是不可能的,上述實驗的結(jié)果有可能是由于回復(fù)突變造成的。Mishra改進(jìn)了設(shè)計,用含有溫度敏感肌醇等位基因突變菌株的DNA來處理肌醇缺陷型菌株,得到了溫度敏感轉(zhuǎn)化菌株。隨后,Case等證實DNA介導(dǎo)的粗糙鏈孢霉遺傳轉(zhuǎn)化,在轉(zhuǎn)化子中含有整合于染色體上的質(zhì)粒DNA片段。此后據(jù)不完全統(tǒng)計,已有超過100種絲狀真菌實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化(表1)[20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31]。2關(guān)于絲狀真菌基因的提取技術(shù)的研究2.1基因缺失修飾基因敲除(Geneknockout)又稱基因打靶(Genetargeting),是對序列已知但功能未知的基因,從分子水平上設(shè)計實驗,將該基因去除或用其它順序相近的基因取代,根據(jù)宿主的形態(tài)、生理生化特性等的變化來推測相應(yīng)基因的功能。絕大多數(shù)的基因敲除策略都是基于同源重組(Homologousrecombination,HR)機(jī)制。利用此技術(shù)可以在分子水平上將目標(biāo)基因進(jìn)行定向修飾,包括基因失活、引入點突變、缺失突變和插入外源片段等,并可將修飾后的遺傳信息在生物體內(nèi)表達(dá),從而通過表型的變化揭示目標(biāo)基因的功能。目前已有多種真菌構(gòu)建了含豐富類型轉(zhuǎn)化子的突變體庫。2.2同源序列雙交換現(xiàn)象通過同源重組(HR)整合外源基因的效率在不同種甚至不同菌種之間是不同的。目標(biāo)整合依賴于目標(biāo)基因兩端與選擇標(biāo)記基因兩端的同源序列之間雙交換(圖1)?；蛲粗亟M現(xiàn)象首次在哺乳動物細(xì)胞中證實存在,這為基因敲除技術(shù)的創(chuàng)立奠定了理論基礎(chǔ)。之后近20年來,此技術(shù)已經(jīng)由在酵母和哺乳動物中的應(yīng)用,拓展到了植物、真菌基因功能研究中,主要包括敲除載體構(gòu)建、敲除載體的真菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選和目的敲除轉(zhuǎn)化子鑒定等。2.2.1in-sfson克隆技術(shù)敲除載體由四部分組成,包括與靶序列兩端同源的同源臂序列(HRS1和HRS2),中間的篩選標(biāo)記基因序列以及載體序列。大多數(shù)已報道的對目的基因進(jìn)行研究的方法都基于傳統(tǒng)的克隆策略來構(gòu)建敲除載體,包括體外轉(zhuǎn)座子突變、酶切連接、FusionPCR、Split-marker-basedATMT等方法。在利用這些方法構(gòu)建敲除載體的過程中,由于需要多步克隆,或者受酶切位點的限制等因素,構(gòu)建載體費時費力。隨著生物學(xué)的發(fā)展,對于重組片段的組合,形成了多種新型技術(shù),克隆只需一步完成,主要包括In-Fusion克隆技術(shù)和USER(Uracilspecificexcisionreagent)克隆技術(shù)。In-Fusion依賴于In-Fusion酶3′-5′外切酶活性,關(guān)鍵技術(shù)就是在進(jìn)行PCR兩端引物設(shè)計時,在目的基因同源序列的兩側(cè)分別加入與線性化載體兩端相同的堿基各10~15個,這樣經(jīng)過Polymerasechainreaction(PCR)得到的產(chǎn)物兩端就分別帶上了10~15個和載體末端重復(fù)的序列,加入In-Fusion酶后就可以實現(xiàn)類似同源重組的反應(yīng),將PCR產(chǎn)物“置換”到目標(biāo)載體上。該方法不需要借助任何限制性內(nèi)切酶、連接酶,或者磷酸化、補(bǔ)平末端等手段,就可以將任何PCR產(chǎn)物片段精確定向克隆到目的載體上,并且克隆的位置不受酶切位點的限制。另外,該方法對載體沒有特別的要求,任何自備的載體都可以使用。另一種技術(shù)USER克隆對載體則有特殊的要求。USER體系依賴于USER酶,是一種特異性切割尿嘧啶的酶,是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸內(nèi)切酶VIII(一種DNA糖基化酶-裂解酶)的混合物。UDG催化尿嘧啶堿基的切除,形成一個脫堿基(脫嘧啶)位點,但同時保持了磷酸二酯鍵骨架的完整性。核酸內(nèi)切酶VIII的裂解酶活性則分別在脫堿基位點的3′端和5′端裂解磷酸二酯鍵骨架,釋放五堿基的脫氧核糖。磷酸二酯鍵斷裂后,DNA兩端形成3′突出端,即USER克隆位點(USERcloningsites,UCSs)。當(dāng)將載體與經(jīng)過USER酶處理過的PCR片段混合時,便會組裝成一個重組分子。相對In-Fusion方法,USER克隆整合效率要高很多,大概為80%(而In-Fusion整合效率為10%~20%)。2.2.2受體材料的選擇絲狀真菌的DNA轉(zhuǎn)化方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化、限制酶介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化具有受體材料范圍廣、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺傳、DNA多為單拷貝插入等不可比擬的優(yōu)點,因此在絲狀真菌研究中應(yīng)用較為廣泛。周芳芳等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(ATMT)的方法,構(gòu)建了含2000個轉(zhuǎn)化子的棉花黃萎病菌強(qiáng)毒菌株Vd080的突變體庫,并對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化;研究證實,200μmol·L-1的誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS),25℃共培養(yǎng)48h,轉(zhuǎn)化效率達(dá)每106個孢子有150~540個轉(zhuǎn)化子。2.2.3同源重組的檢測在基因敲除過程中,轉(zhuǎn)化子篩選是一個技術(shù)難點。雖然借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化極大地提高了轉(zhuǎn)化效率,但是由于T-DNA自身的性質(zhì),它會隨機(jī)整合到基因組中,造成T-DNA隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子和同源雙交換產(chǎn)生的基因敲除轉(zhuǎn)化子都帶有同樣的選擇標(biāo)記而難以區(qū)分。而且等位基因同源重組的效率相對T-DNA隨機(jī)插入的效率低很多,造成基因敲除轉(zhuǎn)化子的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)化子,往往需要篩選大量轉(zhuǎn)化子才能得到基因敲除的轉(zhuǎn)化子。通過基因重組進(jìn)行基因敲除要求已知靶基因兩端的側(cè)翼序列,但不同生物中所要求的側(cè)翼序列長度不同。在釀酒酵母和裂殖酵母中,同源序列為50~100bp即可實現(xiàn)同源位點的基因替換,同源重組效率可達(dá)到50%~100%;而絲狀真菌通常需要1kb甚至更長的同源序列,重組效率才能達(dá)到10%~30%。而且,絲狀真菌中靶序列與載體上所帶序列的相似性需接近100%。不同菌株相似序列內(nèi)些許變化都可能造成同源重組失敗。Maier等研究了同源序列長度對尖孢鐮孢菌轉(zhuǎn)化和同源重組率的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)同源序列長度為800bp時,同源重組率可達(dá)到93%以上;同源長度為500bp時,同源重組率為70%;而當(dāng)同源片段長度小于400bp時,同源重組率還不到10%。因此在構(gòu)建敲除載體時需根據(jù)不同的菌株選擇合適的同源片段的長度。隨機(jī)插入和同源重組轉(zhuǎn)化子都含有抗性基因,是轉(zhuǎn)化子篩選的難題。為解決該問題,現(xiàn)在研究人員在敲除載體中加入特殊的結(jié)構(gòu)元件或采用特殊的報告基因來提高篩選效率。田李等在農(nóng)桿菌T-DNA之間除了加入同源重組DNA片段,還加入了致死基因單純皰疹病毒胸苷激酶(Herpessimplexvirusthymidinekinase,HSVtk),該致死基因可以使T-DNA轉(zhuǎn)化子不能存活,反過來即提高基因敲除轉(zhuǎn)化子的比例,成功構(gòu)建了敲除載體Pko-ADE4和Pko-chsv,基因敲除轉(zhuǎn)化子的比例分別達(dá)到了87%和44%,大大提高了目的敲除轉(zhuǎn)化子的比例。Mansour等在小鼠胚胎肝細(xì)胞進(jìn)行基因敲除試驗中首先采用了正負(fù)篩選策略,正選擇標(biāo)記可以篩選出發(fā)生重組的轉(zhuǎn)化子,負(fù)選擇標(biāo)記排除發(fā)生非同源重組的轉(zhuǎn)化子。Takahashi等將這種方法用于醬油曲霉,由此推測這一技術(shù)也適用于其它絲狀真菌。Maier等以失活聚酮合酶基因PKS12為選擇標(biāo)記基因,由于失活的pks12基因的菌株會發(fā)生白化現(xiàn)象,建立了禾谷鐮刀菌的高效敲除體系,同源重組率可達(dá)到93%以上。在轉(zhuǎn)化過程中,外源基因整合到受體染色體上時,主要有兩種重組途徑涉及到雙鏈DNA破壞修復(fù)(DSBs),即同源重組(HR)途徑和非同源末端連接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)途徑。前者主要依賴于同源片段,后者不需要同源片段即可整合到宿主細(xì)胞染色體上。另外,在人類細(xì)胞中,NHEJ途徑受特異蛋白因子如DNA依賴型蛋白激酶、Ku70、Ku80以及DNA連接酶IV-Xrcc4復(fù)合物的影響,這些影響因子在真菌和人類細(xì)胞中相對保守。因此一種解決重組效率低的方法是構(gòu)建失活NHEJ菌株。有報道稱,Ku70缺失菌株同源重組率幾乎接近100%。然而,JieFeng等構(gòu)建了葉枯病菌穎枯殼針孢Ku70缺失菌株,并證實與野生型相比,缺失菌株同源重組率顯著提高,但并不像先前報道的那么高。FangZhe等構(gòu)建了ligD缺失突變體,證明同源重組率由原來的不到2%上升到85%。但總體來說,構(gòu)建NHEJ缺失菌株確實比野生型菌株同源重組率高。綜上所述,對目的敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選主要有以下幾種方法,常規(guī)的同源重組交換(即不需要對受體菌及載體做任何特殊的處理),對受體菌進(jìn)行改造(即將敲除掉KU70/KU80等阻斷NHEJ途徑的基因的內(nèi)生真菌作為受體菌),敲除載體中加入致死基因(即在敲除載體中加入1個致死基因,如HSVtk,來提高篩選率)和表型篩選(即敲掉某表達(dá)表型的基因后,通過表型的變化來對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選)。從表2可以明顯看出,其它3種方法都要比常規(guī)的HR方法重組率要高得多,對于采用哪種方法最好,并沒有絕對的說法,研究者需根據(jù)內(nèi)生真菌的性質(zhì)以及敲除基因的表型等進(jìn)行選擇。2.2.4轉(zhuǎn)化子的確定3基因功能研究在絲狀真菌研究中,功能驗證的研究方法各有優(yōu)缺點,基因敲除是以同源重組為理論基礎(chǔ)的先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù),具有整合位點單一、精確等優(yōu)點。但是基因敲除可能導(dǎo)致某基因功能的缺失,但生物體可能存在某些代謝補(bǔ)償途徑,使敲除表型被掩蓋或發(fā)生變化,因此,僅僅從最后表型判斷有時并不能從本質(zhì)上揭示某基因的功能。任何一種基因功能研究方法可能在某一個體系效果較好,在另一個體系較差。采取哪一種方法主要取決于實踐經(jīng)驗、不同物種及研究目標(biāo),因此要全面系統(tǒng)地研究某一基因的功能,通常需要嘗試應(yīng)用多種技術(shù)體系。越來越多的絲狀真菌測序的完成及現(xiàn)代分子生物學(xué)手段的快速發(fā)展,基因功能的研究逐漸成為研究熱點,研究者在工作中,改進(jìn)和發(fā)展了多種高效敲除基因的手段。相信在不久的將來,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化基因敲除技術(shù)廣泛使用,對基因功能的研究將會變得更加快速全面高效。對轉(zhuǎn)化子的鑒定,通常使用的方法有分子鑒定和表型觀測。分子鑒定是使用選擇標(biāo)記基因引物和目標(biāo)基因引物擴(kuò)增來驗證轉(zhuǎn)化子或者以目標(biāo)基因為探針進(jìn)行Southern雜交來鑒定轉(zhuǎn)化子。表型驗證是觀察野生型與突變體表型,或者構(gòu)建互補(bǔ)載體,得到互補(bǔ)突變體,觀察野生型和互補(bǔ)突變體表型最終驗證目標(biāo)基因的功能。田李等構(gòu)建了ADE4(腺嘌呤合成酶基因)和ChsV(幾丁質(zhì)合成酶基因)敲除突變體,采用分子生物學(xué)證據(jù),即分別以野生型菌株和轉(zhuǎn)化子菌株基因組為模板,潮霉素抗性基因HPH引物和目的基因引物同時PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明野生型只能擴(kuò)出目的基因一條帶,陽性轉(zhuǎn)化子只能擴(kuò)出HPH一條帶,而非陽性轉(zhuǎn)化子則可以同時擴(kuò)出HPH和