穗花杉雙黃酮在家兔體內的藥物代謝研究

穗花杉雙黃酮在家兔體內的藥物代謝研究

綏化山維斯黃酮是柏樹科普遍存在的雙黃酮，具有抗炎、抗炎、抗癌、腫瘤、降血糖、血管擴張等多種生物活性。由于穗花杉雙黃酮具有顯著的活性作用,正在開展針對它的一系列新藥研究。但穗花杉雙黃酮是一種難溶性的化合物,關于其體內代謝的研究甚少。為改進新藥設計,優(yōu)選給藥方案,充分發(fā)揮其生物活性在臨床用藥中的療效,本文重點研究穗花杉雙黃酮在家兔體內血液中的測定方法,為進一步研究穗花杉雙黃酮在家兔體內的藥物動力學研究提供理論和實驗依據(jù)。1材料表面1.1儀器、試劑與儀器日本島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp泵,SPD-10AvpUV-VIS檢測器,CTO-6A柱溫箱),色譜3000工作站,KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),StarsoriusfDSI型電子分析天平(d=0.01mg,北京賽多利斯天平有限公司),WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司),菲恰爾TGL-12C離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。1.2動物和實驗藥物1.2.1動物雄性新西蘭家兔,體質量(2.0±0.20)kg,武漢生物制品研究所提供,合格證號:SCXK(鄂)2008-0003。1.2.2對照品的制備甲醇(美國VBS公司)、乙腈(天津市西華特種試劑廠)均為色譜純,四氫呋喃(天津市永大化學試劑有限公司)、三氟乙酸、磷酸二氫鈉(南京化學試劑廠)等均為分析純,水為重蒸水,穗花杉雙黃酮對照品(實驗室自制,純度>99.0%)。2方法和結果2.1流動相及水溶液色譜柱:Cosmosil5C18-MS-Ⅱwaters(250mm×4.6mm,5μm);流動相:以乙腈為流動相A,水溶液(含2%的四氫呋喃,0.1%的三氟乙酸)為流動相B進行梯度洗脫(見表1);pH為2.2;流速:1.0ml·min-1;柱溫:30℃;檢測波長:335nm;進樣量:20μl。理論塔板數(shù)按穗花杉雙黃酮計算應不低于200000。2.2對照品儲備液取穗花杉雙黃酮對照品2.05mg,用甲醇溶解并稀釋定容至10ml,作為對照品儲備液。將儲備液逐級稀釋配制成濃度分別為10.25,5.125,2.05,0.205,0.1025μg·ml-1的對照溶液。2.3乙酸乙酯的制備精密吸取家兔血樣500μl,加入500μl的NaH2PO4飽和溶液沉淀蛋白,用4ml的乙酸乙酯萃取,旋渦5min,4000r·min-1離心10min,轉移有機相3000μl至另一離心管,重復萃取一次,合并兩次有機相,用氮氣吹干。殘留物用500μl甲醇溶解,0.45μm濾膜過濾,取20μl進行液相分析。2.4去蛋白色譜法測定血清中雙黃酮的水平分別取穗花杉雙黃酮對照溶液、經(jīng)“2.3”項操作后得到的家兔空白血清溶液、加穗花杉雙黃酮對照品的血清溶液和家兔給藥75min后血清溶液20μl,注入液相儀器,按上述色譜條件進行測定。色譜圖見圖1。結果表明,用上述血樣處理方案處理空白血樣和含藥血樣,在穗花杉雙黃酮出峰處無干擾,專屬性好。2.5含標血清的測定分別取穗花杉雙黃酮不同濃度的對照液適量,氮氣吹干,加入0.5ml家兔空白血清,旋渦混合,配成血清中含對照品濃度分別為0.0512,0.1025,0.5125,1.025,2.05μg·ml-1的含標血清。按“2.3”項處理血樣,進行分析。以穗花杉雙黃酮的峰面積Y為縱坐標,以血清中標準品的濃度X為橫坐標,作標準曲線,回歸方程為Y=12293X+340.31,r=0.9995(n=5),線性范圍為0.0512～2.05μg·ml-1。最低檢測濃度為0.0512μg·ml-1。2.6血樣的測定分別取穗花杉雙黃酮對照液適量,氮氣吹干,加入0.5ml家兔空白血清,渦旋混合,配成低、中、高3個濃度(0.0512,0.5125,2.05μg·ml-1),按“2.3血樣預處理”項處理血樣。3個不同濃度在日內每個測定3次。從低到高3個濃度的RSD分別為2.00%,1.48%,0.76%。2.7血清回收率配制低、中、高3個濃度(0.0512,0.5125,2.05μg·ml-1)的含標血樣各6份,按“2.3”項處理血樣。依據(jù)標準曲線計算各自的濃度,計算相對回收率。另配制相應濃度穗花杉雙黃酮對照品溶液,直接進樣檢測,記錄峰面積。計算血清標準峰面積與對照品峰面積的比值,即為絕對回收率。結果見表2。2.8平均濃度及rsd配制0.5125μg·ml-1濃度的血樣,對其放置-20℃冰箱5,15,30d后的濃度進行考察,測出平均濃度為0.4994μg·ml-1,RSD為3.41%。結果表明血液樣品放置30d內穩(wěn)定性良好。2.9灌胃給藥對家兔血藥濃度的影響將江南卷柏的總黃酮提取物0.3020g(含穗花杉雙黃酮0.0707g)用水稀釋,灌胃給家兔,分別在給藥15,30,45,60,75,120,150,180,240,320,420min后從耳緣靜脈取血2ml,按上述方法檢測。結果發(fā)現(xiàn),在給藥75min后,家兔的血藥濃度達到0.5928μg·ml-1,其他時間點濃度太低。濃度-時間曲線圖見圖2。3討論3.1穗花杉雙黃酮最大吸收的測定以甲醇為溶劑配制穗花杉雙黃酮對照溶液,在200～600nm間進行光譜掃描,結果表明穗花杉雙黃酮在335nm處有最大吸收。因此選擇335nm作為檢測波長。3.2沉淀蛋白的萃取實驗中嘗試分別用甲醇、乙腈、飽和NaH2PO4溶液再用乙酸乙酯、只用乙酸乙酯等方法處理血樣。結果表明,用飽和NaH2P04溶液沉淀蛋白再用乙酸乙酯萃取的方法較好,空白干擾少,甲醇次之,乙腈效果較差,只用乙酸乙酯直接萃取雖然回收率也較高,但未對血樣蛋白進行沉淀,容易污染色譜柱,不可取。所以最終選擇用飽和NaH2PO4溶液沉淀蛋白再用乙酸乙酯萃取的方法處理血樣。在血樣處理中對用乙酸乙酯萃取的次數(shù)也進行了研究