血根堿對(duì)體外培養(yǎng)的人類(lèi)宮頸癌hela和siha細(xì)胞的影響

血根堿對(duì)體外培養(yǎng)的人類(lèi)宮頸癌hela和siha細(xì)胞的影響

宮頸發(fā)病率在中國(guó)女性生殖器官腫瘤中最高。因此，選擇抗宮頸藥物具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。在中藥中篩選有效且毒副作用小的抗腫瘤藥物已成為中草藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。血根堿(sanguinarine,SAN)的化學(xué)名稱(chēng)為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,分子量為367.8,它來(lái)源于罌粟科植物博落回的果實(shí)。早期的研究發(fā)現(xiàn),它具有抗炎、抗菌、抗氧化作用,并對(duì)中樞神經(jīng)有麻醉作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),它還具有非常好的抗腫瘤功效,目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)任何SAN抗腫瘤研究的報(bào)道,即使在國(guó)外也主要集中在體外抗乳腺癌、前列腺癌等少數(shù)幾種腫瘤的研究。2002年Ding等曾研究過(guò)SAN對(duì)抗藥性宮頸癌細(xì)胞的影響。我們利用兩種不同的人類(lèi)宮頸癌細(xì)胞株研究了血根堿的抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料和方法1.1細(xì)胞、培養(yǎng)基和血清本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了HeLa細(xì)胞作為宮頸腺癌的代表,Siha細(xì)胞作為宮頸鱗癌的代表。這兩株細(xì)胞均購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。SAN(>99.0%)、胰酶、活細(xì)胞代謝物還原劑噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DM-SO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,D-MEM培養(yǎng)基和血清購(gòu)于Gibcol公司。SAN由DMSO溶解制備成2mmol/L的儲(chǔ)備液,-20℃下保存?zhèn)溆谩?.2酶活劑即充填液取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞接種并培養(yǎng)于37℃、含5%CO2飽和濕度條件下24h。直接采用培養(yǎng)液稀釋SAN到實(shí)驗(yàn)所需濃度。對(duì)照組則僅加DMSO,其濃度與最高SAN藥物濃度組一致,但所有實(shí)驗(yàn)中DMSO含量均低于1/104。1.3mtt法確定了抗癲癇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響1.3.1mtt法培養(yǎng)適合不同的細(xì)胞系統(tǒng)影響用0.25%的胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,將5×104個(gè)/ml的HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種200μl。在37℃、含5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)24h后,加入濃度分別為0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5和5.0μmol/L的SAN,每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。然后在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后,加入20μl濃度為5mg/ml的MTT,再培養(yǎng)4h后輕輕吸掉培養(yǎng)基。加入100μlDMSO振蕩溶解10min。在酶標(biāo)儀上選取570nm主波長(zhǎng)和630nm參考波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值,對(duì)照組細(xì)胞存活率設(shè)為100%,其余各組細(xì)胞存活率=(各濃度組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。1.3.2細(xì)胞存活率測(cè)定細(xì)胞同上法培養(yǎng)24h后,加入1.5μmol/L的SAN后分別于12、24、36、48和60h時(shí)測(cè)定細(xì)胞存活率。其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.1中所述。1.4細(xì)胞毒性檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml,將HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞分別接種于直徑為60mm的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24h后加入0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0μmol/L的SAN,每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后用胰酶消化制備單細(xì)胞懸液,以500個(gè)細(xì)胞/皿接種至60mm的培養(yǎng)皿,每個(gè)計(jì)量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣,培養(yǎng)14d后經(jīng)PBS漂洗、甲醇固定、Gimsa染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù),含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落作為一個(gè)克隆計(jì)數(shù)。1.5細(xì)痕的制備和生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定采用體外劃痕方法測(cè)定細(xì)胞浸潤(rùn)能力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按1×106個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)至細(xì)胞完全飽和。用無(wú)菌的200μl的槍頭垂直劃出一無(wú)細(xì)胞的細(xì)痕,制作培養(yǎng)細(xì)胞傷口模型。接著用PBS小心清洗3次,去除漂浮細(xì)胞(此時(shí)作為劃痕后零時(shí)),每孔加2ml培養(yǎng)基和0.5μmol/LSAN(此濃度對(duì)HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用均<10%)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)平行樣。對(duì)照組和0.5μmol/L劑量組分別培養(yǎng)24h和48h后顯微鏡下觀察劃痕寬度,數(shù)碼照相機(jī)拍照,測(cè)量劃痕寬度。1.6b指示系統(tǒng)s所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上,結(jié)果均以x±s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1兩組患者治療前后hela細(xì)胞存活率的比較MTT比色法顯示HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞經(jīng)SAN處理24h后,細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯抑制,并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性(圖1)。例如,與未處理對(duì)照細(xì)胞相比(設(shè)為100%),0.5μmol/LSAN處理后,HeLa細(xì)胞的存活率為85.3%(P<0.05,95%CI為77.9%~92.8%);當(dāng)SAN濃度增加為1μmol/L時(shí),HeLa細(xì)胞的存活率降低到57.5%(P<0.01,95%CI為52.2%~62.8%);5μmol/LSAN處理后,HeLa細(xì)胞的存活率僅約為3%(P<0.01;95%CI為1.2%~5.7%)(IC50為4.86μmol/L)。而在1μmol/L和5μmol/LSAN處理后,Siha細(xì)胞的存活率分別約為72%和10%(P<0.01;95%CI分別為70.0%~75.9%和5.6%~11.5%)(IC50為5.95μmol/L)。顯然,Hela細(xì)胞對(duì)SAN處理的敏感性比Siha細(xì)胞高。當(dāng)我們將1.5μmol/LSAN加至細(xì)胞培養(yǎng)中,然后在處理后12、24、36、48和60h檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),HeLa和Siha兩種細(xì)胞的存活率都逐漸減小(圖2),即呈明顯的處理時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。和圖1結(jié)果一致,HeLa細(xì)胞較Siha細(xì)胞對(duì)SAN處理更為敏感。2.2兩組細(xì)胞內(nèi)克隆數(shù)的比較取500個(gè)細(xì)胞/皿接種培養(yǎng)14d后,對(duì)照組HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的克隆數(shù)分別達(dá)到33和33.3個(gè),即大約15%的細(xì)胞克隆形成率。隨著SAN濃度的增大,HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的克隆數(shù)則逐漸減少,呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系(圖3)。如1.0μmol/LSAN處理24h后,HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的克隆形成數(shù)分別為14和16個(gè),而當(dāng)SAN濃度增加到3μmol/L時(shí),HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的克隆形成數(shù)分別為2和3個(gè),和對(duì)照組相比,SAN處理組的克隆形成數(shù)隨著濃度的增加逐漸減低(P<0.05)。2.3兩組“細(xì)胞口腔”寬度對(duì)比0.5μmol/LSAN處理HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞48h后,對(duì)照組“細(xì)胞傷口”寬度分別為(0.51±0.04)mm和(0.64±0.02)mm,處理組“細(xì)胞傷口”寬度為(1.22±0.02)mm和(1.63±0.01)mm。兩組分別相比,P<0.01和P<0.05。結(jié)果提示,SAN處理后顯著抑制了HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力,即覆蓋“細(xì)胞傷口”的能力,并呈時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。體外劃痕試驗(yàn)鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。3化合物的體外生長(zhǎng)作用宮頸癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤,中、晚期腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。因此,能更好地抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的新藥成為當(dāng)今腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)熱門(mén)研究方向。SAN是從傳統(tǒng)中藥罌粟科博落回中提取的一種生物堿,具有多種藥理作用及用途。有研究發(fā)現(xiàn),它具有廣譜的抗菌作用,具有改善肝功能及增強(qiáng)免疫力的功能,對(duì)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞都有刺激作用。近年來(lái)的研究表明,SAN在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)多種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞如乳腺癌MCF-7細(xì)胞,前列腺癌LNCaP、DU-145和PC-3細(xì)胞、白血病K562細(xì)胞、胰腺癌AsPC和BxPC-3細(xì)胞和皮膚癌A431等有非常好的抑制生長(zhǎng)的作用。我們將SAN直接加入HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞培養(yǎng)液中24h后,MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí),SAN對(duì)HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)都有顯著的抑制作用,并呈劑量依賴(lài)性,隨著SAN濃度的增加,其細(xì)胞生存率隨之逐漸下降,并且HeLa細(xì)胞較Siha細(xì)胞更為敏感。已有實(shí)驗(yàn)室研究表明,SAN的抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用與細(xì)胞周期阻