5個(gè)野生中華卷柏中雙黃酮的分布特征

5個(gè)野生中華卷柏中雙黃酮的分布特征

在長期的進(jìn)化過程中，植物產(chǎn)生了大量不利于自身生存競爭的后代產(chǎn)物，用于與其他生物相互作用，適應(yīng)自然的選擇。這些次生代謝產(chǎn)物在植物的生理調(diào)節(jié)、自身保護(hù)、生存競爭、協(xié)調(diào)與環(huán)境關(guān)系等生命活動(dòng)的許多方面均起著重要作用［２］。藥用植物的大多數(shù)有效成分為植物的次生代謝產(chǎn)物,因其種類、含量及結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,次生代謝產(chǎn)物在植物中的分布散亂不一,這種多樣性不僅表現(xiàn)在不同種類的植物上,即使是來自于不同產(chǎn)地的同種植物,其化學(xué)成分往往也有顯著差異。例如,在相同的種植條件下,不同種質(zhì)的美國黃松(Pinusponderosavar.ponderosa)中生物堿存在著差異［３］,澳洲大陸上不同群體苦橄欖科愛莎木屬長葉莎木(Ere-mophilalongifolia)的精油組分有3種化學(xué)型［４］。東莨菪堿在保加利亞和埃及產(chǎn)的曼陀羅(Daturainnoxi)種子中均可檢測到,而天仙子胺僅在保加利亞產(chǎn)的曼陀羅根中存在,莨菪堿卻僅在埃及產(chǎn)的曼陀羅根中才有［５］。同時(shí),處于不同生長發(fā)育階段的同一植物,因其體內(nèi)的基因表達(dá)不同,也會(huì)使次生代謝產(chǎn)物的種類和含量發(fā)生變化,Francisco等［６］研究發(fā)現(xiàn),不同時(shí)期的蕪菁(Brassicarapa)中總酚和芥子油苷的含量存在較大差異。中華卷柏(Selaginellasinensis)是卷柏科(Se-laginellaceae)卷柏屬植物,為中國特有種,主要分布于中國華北、東北等地,多生長在山坡陰處巖石上、山頂巖石上、向陽山坡石縫中及山坡灌叢下［７］。因其具有清熱利尿、消炎止血等功效,尤其是所含的穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮,具有防癌治癌［８－９］、抗病毒［１０－１１］和增強(qiáng)人體免疫功能［１２］等多種藥理活性,被作為傳統(tǒng)中藥廣泛使用［１３］。目前,有關(guān)中華卷柏的研究主要集中在其全株中雙黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)、提取分離、藥理活性等［１４－１７］方面,而對(duì)于中華卷柏藥用活性成分的地理分布研究尚未見報(bào)道。為此,本研究分析了不同生長發(fā)育期、不同產(chǎn)地野生中華卷柏中穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮的組織部位差異,闡明中華卷柏中活性成分的分布特征,為中華卷柏次生代謝產(chǎn)物的科學(xué)利用提供依據(jù)。1材料和方法1.1植物標(biāo)本采集7月中華卷柏處于營養(yǎng)葉期,10月中華卷柏處于孢子葉期,因此,分別于2011年的7月和10月中旬采集樣品。樣品采集點(diǎn)選擇在中華卷柏主產(chǎn)地太行山的5個(gè)山區(qū):小五臺(tái)山(太行山北部、最高峰)、梁溝山區(qū)(太行山西南部)、摩天嶺(太行山東部)、獅子峰(太行山腹地)、萬仙山(太行山南部)。采集的植物樣本經(jīng)河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院韓留福教授鑒定為中華卷柏(Selaginellasinensis),保留植物標(biāo)本Zhanghao(HBNUH201107023)、Zhaoxin(HDCH201110005)、Zhanghao(HDCH201107018)、Zhaoxin(HDCH201107068)、Zhaoxin(HDCH201107003)。每個(gè)產(chǎn)地選取5個(gè)自然居群,每個(gè)居群隨機(jī)選取10簇中華卷柏,其中5簇直接裝袋(作為全株樣品),另5簇按根、莖、營養(yǎng)葉和孢子葉(僅10月份才有,分空孢子穗、大孢子和小孢子)分別裝袋,于80℃烘干至恒質(zhì)量,將樣品研磨成粉末狀,備用,記錄樣品編號(hào)、采集地、海拔、經(jīng)緯度等相關(guān)信息(表1)。1.2高效液相色譜法檢測穗花杉雙黃酮(批號(hào)111902-201102)和扁柏雙黃酮(批號(hào)19202-20110517)標(biāo)準(zhǔn)品,由中國藥品生物制品檢定所提供。參照劉海青等［１８］的液相色譜檢測方法,采用Waters公司的e2695-2489高效液相色譜儀和SymmetryC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm,美國);條件為,流動(dòng)相:甲醇和0.05mol/L磷酸二氫鈉,梯度洗脫,0~6min,甲醇57.5%~70%;柱溫40℃,流速1.5mL/min,檢測波長330nm,進(jìn)樣量10μL。分別配制穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣檢測,以峰面積(Y)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸分析,繪制穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3提取液用量的確定精密稱取0.1g中華卷柏全株及各部位樣品,置于10mL容量瓶中,加入約10mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇,60℃下超聲提取40min,冷卻至室溫,再用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容到10mL,10000r/min離心10min,取上清液,備檢。1.4穗花杉雙黃酮和埋柏雙黃酮含量的測定采用1.2節(jié)HPLC方法檢測樣品,每個(gè)樣品重復(fù)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮的質(zhì)量,并據(jù)此計(jì)算2種物質(zhì)的含量及其在各器官中的分配比,含量=質(zhì)量/樣品干質(zhì)量,即每克植物樣品中穗花杉雙黃酮或扁柏雙黃酮的質(zhì)量(mg);器官分配比=器官中含量×器官干質(zhì)量/(全株含量×全株干質(zhì)量)。1.5數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Duncan法進(jìn)行多重比較。2結(jié)果與分析2.1建立雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y１=6×10９X１-69562,R２=0.9990;扁柏雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y２=4×10９X２-165324,R２=0.9993。穗花杉雙黃酮含量為0.74~15.76mg/g、扁柏雙黃酮含量為0.79~15.43mg/g時(shí),其峰面積與對(duì)應(yīng)溶液的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。2.2穗花杉雙黃酮含量的比較穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮在不同產(chǎn)地中華卷柏全株中的含量差異見表2。由表2可見,5個(gè)產(chǎn)地的中華卷柏中均含有穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮,但二者的含量及分布規(guī)律不同;穗花杉雙黃酮的含量均高于扁柏雙黃酮。梁溝山區(qū)中華卷柏全株中的穗花杉雙黃酮含量在不同的生長發(fā)育時(shí)期均最高,分別為5.498(7月)和6.624(10月)mg/g;萬仙山最低,分別為2.014(7月)和3.725(10月)mg/g,二者差異均達(dá)顯著水平;小五臺(tái)山和摩天嶺中華卷柏全株中穗花杉雙黃酮的含量接近,且均顯著高于獅子峰所產(chǎn)中華卷柏。7月樣品中,小五臺(tái)山中華卷柏中的扁柏雙黃酮含量最高,為1.261mg/g;10月樣品的扁柏雙黃酮含量以梁溝山區(qū)所產(chǎn)中華卷柏最高,為1.797mg/g;最低均為萬仙山,分別為0.958(7月)和0.968(10月)mg/g,與最高值差異均達(dá)顯著水平;其余3個(gè)產(chǎn)地中華卷柏中的扁柏雙黃酮含量接近。2.3同一產(chǎn)地不同發(fā)育時(shí)期同年生穗花杉、對(duì)于雙黃酮含量的差異由表2可見,穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量在生長發(fā)育期的中華卷柏全株中分布規(guī)律比較一致,即孢子葉期(10月)穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮的含量均高于營養(yǎng)葉期(7月);同一產(chǎn)地不同生長發(fā)育時(shí)期中華卷柏中穗花杉雙黃酮含量的差異均達(dá)顯著水平;而獅子峰和萬仙山的中華卷柏2個(gè)時(shí)期的扁柏雙黃酮含量差異不顯著。2.4選擇“中華卷柏”的主要部位分布特征穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮在中華卷柏不同部位的分布特征見圖1和圖2。對(duì)于穗花杉雙黃酮來說,其在中華卷柏各部位中的分布規(guī)律為營養(yǎng)葉>莖>根;10月在獅子峰及7月在萬仙山采集的中華卷柏營養(yǎng)葉與莖中的穗花杉雙黃酮含量差異不顯著,其余樣品(同一月份和地點(diǎn))中營養(yǎng)葉、莖、根的穗花杉雙黃酮含量差異均顯著(圖1)。對(duì)于扁柏雙黃酮來說,其在中華卷柏各部位中的分布特征與穗花杉雙黃酮相似,均表現(xiàn)為營養(yǎng)葉>莖>根;除10月摩天嶺和獅子峰的莖與根不顯著外,其余產(chǎn)地同一時(shí)期樣品差異均顯著;與穗花杉雙黃酮不同的是,小五臺(tái)山、摩天嶺、獅子峰和萬仙山的中華卷柏莖中的扁柏雙黃酮在孢子葉期均低于營養(yǎng)葉期,差異不顯著(圖2)。10月,中華卷柏的孢子葉發(fā)育成熟,由空孢子穗、大孢子和小孢子組成。由表3可見,空孢子穗中的穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量最高,其次是小孢子,最低的是大孢子,三者之間差異顯著。且空孢子穗和小孢子中的穗花杉雙黃酮含量顯著高于扁柏雙黃酮,分別是扁柏雙黃酮含量的4.10倍和2.40倍;而大孢子中的穗花杉雙黃酮含量卻明顯低于扁柏雙黃酮,不到扁柏雙黃酮的1/3。2.5文獻(xiàn)中穗花杉雙黃酮和生物量分配從圖3可以看出,穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮分布有明顯的組織部位差異,穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮在中華卷柏各組織部位中的分配比例均表現(xiàn)為在營養(yǎng)葉中最高,分別是36.7%和35.3%;其次是莖,所占比例分別為29.1%和26.2%;再次是孢子葉,分別為26.9%和24.9%;在根中比例最低,分別為7.3%和13.6%。在孢子葉中,穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮的分配總體上以空孢子穗最高,分別是71.8%和51.3%;小孢子次之,大孢子最低。不過,大孢子中穗花杉雙黃酮的分配比僅為1.7%,是扁柏雙黃酮(16.3%)的1/10。3產(chǎn)生原生物代謝產(chǎn)物的主要部位次生代謝產(chǎn)物的合成是由植物的發(fā)育程度、組織分化及外界刺激因素通過影響生物合成基因表達(dá)而控制的［１９］。不同的地域環(huán)境,會(huì)誘導(dǎo)植物的次生代謝發(fā)生顯著變化［２０］。高海拔溫涼生境中短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus)的黃酮含量較高［２１］。在對(duì)愛沙尼亞不同地區(qū)栽培金盞花(Calendulaoffi-cinalisL.)的研究中發(fā)現(xiàn),總黃酮含量與栽培地區(qū)有關(guān)［２２］。本研究也發(fā)現(xiàn),穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量在梁溝山區(qū)的中華卷柏中較高,而含量較低的是萬仙山的中華卷柏。同樣,生長發(fā)育期往往也會(huì)影響植物的次生代謝。Kazlauskas等［２３］研究發(fā)現(xiàn),伴隨著貫葉連翹(HypericumperforatumL.)生殖組織的生長和發(fā)育,其次生代謝加速,增強(qiáng)了一些次生代謝產(chǎn)物如蘆丁、櫟皮精的積累。Cirak等［２４］也發(fā)現(xiàn),土耳其生長的金絲桃中的綠原酸和金絲桃苷含量隨著金絲桃生長發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)而降低,而黃酮苷和槲皮苷含量則升高。本研究也發(fā)現(xiàn),隨著中華卷柏孢子葉的形成,中華卷柏的次生代謝得到促進(jìn),穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮的含量均有所增加。關(guān)于次生代謝產(chǎn)物含量在不同組織部位的差異,不同的研究得到的結(jié)果不盡相同。Iranbakhsh等［２５］認(rèn)為,曼陀羅(DaturastramoniumL.)幼苗期根中的生物堿含量高于地上部;而到了花期,根中的含量低于地上部。而Alali等［２６］的研究則發(fā)現(xiàn),在不同的生長階段,約旦秋水仙(Colchicumtunica-tum)地下部秋水仙堿的含量總是高于地上部。本研究結(jié)果顯示,穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量在中華卷柏的營養(yǎng)葉中最高,莖次之,根最低。然而,本研究也發(fā)現(xiàn),對(duì)于產(chǎn)地和發(fā)育期不同的中華卷柏,2種物質(zhì)的分布也存在部位差異。對(duì)于穗花杉雙黃酮來說,總是10月的營養(yǎng)葉、莖、根含量高于7月相應(yīng)的器官;而對(duì)于扁柏雙黃酮來說,只有梁溝山區(qū)的樣品如此,其余4個(gè)產(chǎn)地(小五臺(tái)山、摩天嶺、獅子峰和萬仙山)中華卷柏莖中的含量均為10月低于7月。這說明產(chǎn)地、生長發(fā)育期的差異往往會(huì)刺激植物不同的組織部位產(chǎn)生化學(xué)多樣性。Sandanov等［２７］的研究也發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地、不同發(fā)育期苦參(Sophoraflavescens)中生物堿的含量有部位差異,Tsokto-Khangil產(chǎn)的苦參在花期根莖中生物堿的含量為1.64%,果期為1.31%;與