高脂飼料配方及周齡對(duì)sd大鼠模型胰島素抵抗的影響

高脂飼料配方及周齡對(duì)sd大鼠模型胰島素抵抗的影響

高脂飲食、腹腔注射速尿素（stz）是目前廣泛使用的2型糖尿病模型的制備方法。該模型具有許多與臨床2型糖尿病類(lèi)似的生化代謝及臨床特點(diǎn),是研究2型糖尿病的較為理想的動(dòng)物平臺(tái)。綜觀目前對(duì)于此種模型建立方法的研究報(bào)道,造模方法尚不統(tǒng)一,各位研究者采用的高脂飼料配方和造模動(dòng)物周齡各不相同,導(dǎo)致研究結(jié)果難以復(fù)制或進(jìn)行平行比較。因此,對(duì)于不同造模方法需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行比較,以篩選出最優(yōu)造模方法。前人研究中,關(guān)于造模采用的大鼠周齡以及飼料配方對(duì)于模型建立成功率影響的研究鮮有報(bào)道。為優(yōu)化造模方法,建立穩(wěn)定且成模率高的動(dòng)物模型,本研究觀察不同配方的高脂飼料,以及不同周齡的大鼠對(duì)于該模型的造模成功率和模型病變特點(diǎn)的影響,以篩選出更適合建立此種模型的高脂飼料配方和大鼠周齡,為造模方法的優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)清潔級(jí)雄性3周齡(剛斷乳)SD大鼠26只,體重(60±10)g;清潔級(jí)雄性5周齡SD大鼠26只,體重(120±10)g,來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(京)2006-0001],飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(京)2006-0012],室溫20℃~25℃,相對(duì)濕度50%~60%,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。1.2主要成分的熱量比普通飼料和高脂飼料均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所加工提供。高脂飼料配方一:豬油18%、蛋黃粉10%、大豆油2%、蔗糖10%、酪蛋白20%、蛋氨酸0.3%、淀粉21.7%、糊精9%、纖維素7.5%、膽堿0.3%、多維預(yù)混料0.1%、多礦預(yù)混料0.8%、膽酸鈉0.3%。配方中主要成分提供的熱量比為:豬油35.8%、蛋黃粉15.4%、大豆油4.3%、蔗糖9.6%、酪蛋白17.3%、淀粉17.6%。高脂飼料配方二:豬油12%、蛋黃粉10%、大豆油2%、花生5%、奶粉5%、蔗糖8%、酪蛋白20%、蛋氨酸0.3%、淀粉21.2%、糊精7%、纖維素7.5%、食鹽0.5%、膽堿0.3%、多維預(yù)混料0.1%、多礦預(yù)混料0.8%、膽酸鈉0.3%。配方中主要成分提供的熱量比為:豬油24.5%、蛋黃粉15.6%、大豆油4.4%、花生6.8%、奶粉5.9%、蔗糖7.8%、酪蛋白17.6%、淀粉17.4%。1.3試劑檸檬酸(批號(hào):0602102),檸檬酸鈉(批號(hào):20070403),購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司;STZ,Sigma公司。1.4stz配置配制0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,調(diào)節(jié)pH為4.4;配制1%STZ溶液,溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,在冰浴中操作。1.5動(dòng)物分組m組按體重將26只3周齡大鼠隨機(jī)分為3組:正常一組(N1組)、模型一組(M1組)和模型二組(M2組),其中N1組6只動(dòng)物,M1組和M2組每組各10只動(dòng)物。按體重將26只5周齡大鼠隨機(jī)分為3組:正常二組(N2組)、模型三組(M3組)和模型四組(M4組),其中N2組6只動(dòng)物,M3組和M4組每組各10只動(dòng)物。1.6高脂飼料配方模型N1組和N2組給予普通飼料。各模型組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。其中M1組和M3組給予高脂飼料配方一喂養(yǎng),M2組和M4組給予高脂飼料配方二喂養(yǎng)。4周后,各模型組大鼠腹腔注射STZ溶液35mg/kg;正常組腹腔注射同等劑量0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖(FBG),并進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oralglucosetolerancetest,OGTT),凡空腹血糖值≥7.8mmol/L者納入實(shí)驗(yàn)。1.7指標(biāo)檢測(cè)1.7.1血糖、血脂指標(biāo)檢測(cè)各組動(dòng)物在給予高脂飼料前、注射STZ前及注射STZ4周后(處死前)測(cè)量體重、24h攝食量、飲水量;注射STZ前1d各組經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)、總膽固醇(TG)、甘油三酯水平(TC)。注射STZ后,各組動(dòng)物每周測(cè)定FBG一次。STZ注射后7d以及STZ注射4周后各組大鼠測(cè)定OGTT。STZ注射4周后,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)FBG、FIN、TG、TC水平,并處死所有動(dòng)物。血糖采用美國(guó)強(qiáng)生公司的Onetouch隨手測(cè)血糖儀及血糖試紙測(cè)定。血清胰島素采用中國(guó)原子能科學(xué)研究院I1252胰島素放射免疫分析藥盒測(cè)定,用大鼠標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。血清TC、TG由全自動(dòng)生化分析儀完成測(cè)定。1.7.2葡萄糖曲線下面積大鼠禁食15h后,灌胃給予20%的葡萄糖溶液2g/kg。檢測(cè)0min及葡萄糖灌胃后30、60、120min的血糖,計(jì)算葡萄糖曲線下面積(AUC)=(血糖值0min+血糖值30min)×0.5/2+(血糖值30min+血糖值60min)×0.5/2+(血糖值60min+血糖值120min)×1/2。1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)用表示,組間比較用one-wayANOVA方差分析。2結(jié)果2.1動(dòng)物體重和stz4周后給予高脂飼料前,各模型組大鼠與各自對(duì)照的正常組大鼠的體重水平無(wú)明顯差異(P>0.05);注射STZ前,M1組和M3組動(dòng)物體重均顯著低于各自對(duì)照組水平(P<0.01),M2組和M4組動(dòng)物體重均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01);注射STZ4周后,M1組和M3組動(dòng)物體重均顯著低于各自對(duì)照組水平(P<0.01),M2組和M4組動(dòng)物體重與各自對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。2.2動(dòng)物24h攝食量和飲水量給予高脂飼料前,各模型組大鼠與各自對(duì)照的正常組大鼠的24h攝食量和飲水量水平無(wú)明顯差異(P>0.05);注射STZ前,M1組和M3組動(dòng)物的24h攝食量均顯著低于各自對(duì)照組水平(P<0.01),M2組和M4組動(dòng)物的24h攝食量均明顯高于各自對(duì)照組水平(P<0.05);注射STZ后4周,M1組和M3組動(dòng)物的24h攝食量均顯著低于各自對(duì)照組水平(P<0.01),M2組和M4組動(dòng)物的24h攝食量均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01);各模型組大鼠的24h飲水量均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。2.3stz分次注射前后血糖水平變化的變化見(jiàn)表1、表4M1組和M2組的動(dòng)物在注射STZ后FBG水平先升高后降低,在STZ注射后2周時(shí)達(dá)到最高值然后逐漸降低,至STZ注射后4周觀察結(jié)束時(shí)仍呈下降趨勢(shì),因此認(rèn)為此兩組動(dòng)物的FBG水平在STZ注射后4周內(nèi)尚不穩(wěn)定。M3組和M4組的動(dòng)物在注射STZ后FBG水平先升高,在STZ注射后2周時(shí)達(dá)到高值,至STZ注射后4周觀察結(jié)束時(shí)一直處于比較穩(wěn)定的狀態(tài),因此認(rèn)為此兩組動(dòng)物的FBG水平在STZ注射后2周即達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。M1、M2、M3組的FBG水平在STZ注射后3周均明顯低于M4組水平(P<0.05);在STZ注射后4周均顯著低于M4組水平(P<0.01)。見(jiàn)表3。2.4動(dòng)物tg、tc、fin水平的比較注射STZ前,M2組和M4組動(dòng)物的FIN、TG和TC水平均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01),M1組和M3組動(dòng)物的TG水平均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01);注射STZ4周后,M2組和M4組動(dòng)物的FIN水平均明顯高于各自對(duì)照組水平(P<0.05),TG和TC水平均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01),M1組和M3組動(dòng)物的TG水平均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01)。詳見(jiàn)表4。2.5造模成功率各模型組大鼠成功建立2型糖尿病模型的比率如下:M1組10只大鼠,6只造模成功,造模成功率為60%;M2組10只大鼠,6只造模成功,造模成功率為60%;M3組10只大鼠,7只造模成功,造模成功率為70%;M4組10只大鼠,9只造模成功,造模成功率為90%。2.6兩組對(duì)照組水平比較注射STZ后7d及注射STZ后4周,所有模型動(dòng)物的AUC值均顯著高于各自對(duì)照組水平(P<0.01);注射STZ后4周,M1組和M2組的AUC值均顯著低于M4組水平(P<0.01),M3組的AUC值明顯低于M4組水平(P<0.05)。見(jiàn)表5。3大鼠周齡模型的建立流行病學(xué)的研究提示,高糖、高脂肪的高熱量飲食,會(huì)誘發(fā)IR,增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn),是2型糖尿病發(fā)病的重要因素。這種高熱量飲食可減弱胰島素抑制肝糖輸出的能力,并影響葡萄糖刺激胰島細(xì)胞的胰島素分泌。本研究觀察了不同配方的高糖高脂飼料,以及不同周齡的大鼠對(duì)于該模型的造模成功率和模型病變特點(diǎn)的影響,以篩選出更適合建立此種模型的高脂飼料配方和大鼠周齡,改進(jìn)造模方法。本研究結(jié)果提示,高脂喂養(yǎng)合并腹腔注射小劑量STZ制備2型糖尿病大鼠模型,選取5周齡SD大鼠較為適合,其FBG水平在注射STZ后兩周即可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),并維持在較高的水平;高脂飼料配方二更容易被動(dòng)物接受,攝食量和體重增加明顯,并且成功誘導(dǎo)出IR,更加符合2型糖尿病模型的要求。選取5周齡SD大鼠作為模型動(dòng)物,并給予配方二高脂飼料喂養(yǎng),所建立的大鼠模型血糖、胰島素以及血脂譜(TC、TG)均明顯升高,具備高血糖、高胰島素血癥、血脂異常等2型糖尿病的主要特征,是值得推廣的2型糖尿病動(dòng)物模型。綜觀目前的研究報(bào)道,對(duì)于建立此種模型采用的大鼠周齡鮮有研究者進(jìn)行探討,大鼠周齡的選擇范圍較大,從斷乳(約出生后3周)到8周齡均有報(bào)道。大鼠的生長(zhǎng)和發(fā)育特性隨周齡不同而存在較大差別,對(duì)環(huán)境因素(如營(yíng)養(yǎng)因素)的反應(yīng)也不同。有研究者認(rèn)為,剛斷乳的大鼠未接受過(guò)普通飼料飼養(yǎng),對(duì)于高脂飼料更加易于接受,因此認(rèn)為采用剛斷乳或斷乳不久的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)效果較好。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),3周齡的大鼠與5周齡的大鼠相比,對(duì)于同種高脂飼料的24h進(jìn)食量無(wú)明顯差異,血清FIN、TG和TC水平無(wú)明顯差異。但兩組給予不同高脂飼料的3周齡大鼠與兩組5周齡大鼠相比,造模成功率明顯低于5周齡大鼠,并且造模后4周內(nèi)其FBG水平明顯低于5周齡大鼠。兩組3周齡大鼠的FBG水平在造模后4周內(nèi)均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在觀察時(shí)間內(nèi)FBG水平未達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。認(rèn)為可能與幼齡動(dòng)物處于生長(zhǎng)發(fā)育的高峰期,對(duì)于外界干預(yù)損傷的自愈能力較強(qiáng)有關(guān)。但是作為模型動(dòng)物,在沒(méi)有藥物及其他干預(yù)的情況下,FBG水平在較長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)一直處于波動(dòng)狀態(tài),是不利于進(jìn)行藥物干預(yù)研究的。本研究結(jié)果提示,5周齡大鼠是較為適合的造模動(dòng)物,其FBG水平在注射STZ后兩周即可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),即可進(jìn)行藥物干預(yù)研究。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中大多是在普通飼料中添加10%~20%左右的脂肪,5%~20%左右的蔗糖,另有研究者添加雞蛋、花生、奶粉、食鹽等。飼料中脂肪比例增加是形成肥胖和胰島素抵抗的重要環(huán)境因素。文獻(xiàn)報(bào)道,脂肪熱卡從10%增加到59%,碳水化合物由69%降至20%,4周內(nèi)可以觀察到大鼠體內(nèi)脂肪堆積,外周組織和肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗,體內(nèi)葡萄糖利用率下降超過(guò)50%。但是,脂肪含量過(guò)高的高脂飼料存在難以干燥、質(zhì)軟易碎、口感較差的缺點(diǎn)。配方一中含有18%的豬油,飼料易碎,約有1/3的飼料都是碎末或渣滓而無(wú)法使用。食用此種飼料的兩組大鼠24h攝食量均顯著低于正常飼料組和配方二組,且大鼠體重增長(zhǎng)緩慢,體重顯著低于同周齡的正常飼料組和配方二組動(dòng)物。檢測(cè)結(jié)果提示,服用配方